Development of a diagnostic procedure for VBNC cells of Listeria monocytogenes

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Costa, Olívia Carina Campos da, 1983-
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/8202
Resumo: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012
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spelling Development of a diagnostic procedure for VBNC cells of Listeria monocytogenesListeria monocytogenesAlimentosMétodos de análiseMicrobiologiaDNATeses de mestrado - 2012Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012VBNC state represents a specific differentiation program into a survival state with several modifications in the cells walls and cytoplasmic membrane, a decrease in metabolic activity and maintaining gene expression. This state is induced upon exposure to stressful conditions, including nutrient starvation, different temperatures, pH, oxygen concentration and exposure to light or UV radiation. VBNC cells can represent an unknown public health risk, especially in the food industry, since they are unable to grow in routine analysis bacteriological media. This work aimed to develop a PCR based diagnostic procedure to detect VBNC cells of Listeria monocytogenes, a foodborne pathogen, able to resuscitate. It were defined as PCR targets Imo2522 and Imo0186 genes, due to their potential as Rpfs, and used for primers designo Two more genes were considered for detection, one for L. monocytogenes identification and one as internal amplification control. The Multiplex-PCR reaction established was characterized and had a 50 pg detection limit for the target genes. DNA extraction protocols were developed to yield enough DNA from low bacteria number for Multiplex-PCR detection. However the detection of just a few cells was neve r observed. Therefore it was adopted Lmo0186-PCR reaction with 125 fg DNA detection limit and the ability to detect 1 VBNC cell. Assays performed with PMA, which inhibits amplification from dead cells, revealed the same sensitivity, whereas inclusion of an amplification control decreased it. To overcome this issue a 5-fold increase of DNA sample in PCR reaction was necessary. Protocol application to spiked food revealed a 104 and 106 cells detection limits for active and VBNC cells respectively. ln parallel, VBNC state induction was performed, with different cellular concentrations, in five different induction media. Smaller induction periods were verified in the less concentrated suspensions and a high persistence of injured cells was detected in the higher concentrated suspensions.Discrepâncias de viabilidade bacteriana entre os resultados de contagens realizadas a partir de ensaios de culturabilidade e ensaios indiretos com o objetivo de detetar membranas celulares intactas são relatadas desde os anos de 1800. No entanto, foi apenas na década de 1980 que Byrd and Colwell l introduziram a hipótese da existência de um estado similar à dormência, no qual as células bacterianas poderiam subsistir a condições menos favoráveis à sua sobrevivência, no qual não ocorreria crescimento. Tal estado foi denominado de viável mas não cultivável (VBNC) e a primeira evidência experimental foi obtida por Xu et ai. (1982)2. Segundo Oliver (1993)3 este estado pode ser definido como uma célula que, embora metabolicamente ativa, é incapaz de realizar a divisão celular necessária para o seu desenvolvimento num meio de cultura que normalmente suportaria o seu crescimento. No entanto, a hipótese da existência de um estado VBNC levantou alguma controvérsia entre a comunidade científica, pois este implicaria que os métodos microbiológicos convencionais, que assumem que a culturabilidade é um reflexo direto da viabilidade, não seriam adequados para estudos de quantificação de células viáveis. Existia de facto uma certa resistência de alguns autores em aceitar a existência de um estado VBNC que não seria idêntico a outros estados fisiológicos já descritos, nos quais as células bacterianas não seriam imediatamente cultiváveis em meio de cultura4 - 7. Tendo em conta que muitos dos métodos utilizados para quantificar a viabilidade celular eram indiretos, e como tal discutíveis pelos autores mais céticos, a evidência chave dependeria da capacidade de reanimação das células que haviam entrado no estado VBNC. Assumindo-se que este estado seria um meio de sobrevivência, as células deveriam ter a capacidade de reanimar quando as condições fossem apropriadas ao seu crescimento. Como tal diversas tentativas foram realizadas no intuito de obter a reanimação das células VBNC, mas muitas demonstraram-se infrutíferas dado que não excluíam a possibilidade de recrescimento de uma pequena fração de células cultiváveis ainda presentes na população de células VBNC4 - 6,8. A evidência conclusiva foi obtida por Whitesides and Oliver (1997)9 no estudo com Vibrio vulnificus, no qual a atribuição dos eventos de reanimação à presença de poucas células cultiváveis seria extremamente improvável. Apesar de alguma contestação este estudo, e outros que se seguiram, levaram ao desaparecimento da controvérsia existente, sendo já geralmente aceite que o estado VBNC existe. O estado VBNC representa um programa de diferenciação específico para um estado de sobrevivência após exposição a condições desfavoráveis. Uma das modificações mais associadas a este estado é a redução da dimensão celular, podendo ocorrer a transição de uma morfologia de bacillus para cocóides 5,8,1O. Algumas modificações nas paredes celulares foram também já descritas, nomeadamente o aumento no número total de interligações, incluindo interligações incomuns como DAP-DAP em Escherichia coli, e na quantidade de mucopéptidos covalentemente ligados a uma lipoproteína ll ,12. Tais alterações na parede celular são passíveis de contribuir para uma maior resistência a antibióticos, dado que estes têm como alvo principal as células em crescimento ativo, tendo tal já sido reportados,8,13. Foi igualmente já descrito uma reorganização do subproteoma da membrana celular externa bem como um perfil proteico relativamente diferente aos das células ativas ou no estado de sobrevivência com baixo metabolismo ("starvation survival,,)14. Modificações metabólicas também ocorrem as quais incluem a diminuição da síntese de macromoléculas, do transporte de nutrientes e da taxa de respiração, mantendo-se a absorção de aminoácidos, os níveis de ATP e rRNA e a presença de plasmídeos 5,7,8,15. A contínua expressão de genes foi também detetada, sendo que alguns autores reportaram a contínua expressão de genes de virulência neste estado, enquanto noutros estudos esta expressão não foi detetada, mas no entanto o potencial virulento era mantido e poderia ser retomado após a reanimação das células VBNC 5,8,16,17. Assumindo o estado VBNC como uma estratégia de sobrevivência, a sua indução pode ser despoletada pela exposição a condições não favoráveis à subsistência da célula bacteriana, podendo ser estímulos químicos ou ambientais, tais como falta de nutrientes, diferentes temperaturas, pressões osmóticas, alterações do pH, concentração de oxigénio, presença de metais pesados, ou conservantes alimentares e ainda exposição à luz ou radiação UV. A reanimação das células VBNC demonstrou-se mais complexa, havendo alguns estudos cujos ensaios de reanimação se revelaram infrutíferos, indicando que para alguns microrganismos serão necessários outros fatores que não apenas a inversão do estímulo de indução, e que poderão mesmo incluir a presença de um organismo superior como mediador B,17-20. Os mecanismos responsáveis quer pela indução do estado VBNC quer pela reanimação ainda não são conhecidos, no entanto alguns dados relevantes foram já demonstrados. No caso da indução o peróxido de hidrogénio parece ter um papel importante, dado a incapacidade de metabolização deste composto, bem como o fator sigma alternativo RpoS que parece ser um regulador da indução do estado VBNC 5,8,21. Na reanimação há evidências que um grupo de proteínas extracelulares, denominadas fatores de promoção de reanimação ("resuscitation promoting factors" - Rpfs), estarão envolvidas no processo de reanimação, tendo sido já identificadas em diferentes géneros. Estas proteínas apresentam semelhanças com transglicolases solúveis e estarão envolvidas em alterações da parede celular. Outro tipo de Rpfs possivelmente associadas serão as autoindutoras do crescimento estáveis ao calor ("heat-stable autoinducers of growth") que aparentam ser moléculas de sinalização secretadas. Apesar de ainda existirem muitos parâmetros a desvendar no estado VBNC, a existência do mesmo já foi descoberta em vários microrganismos, incluindo patogéneos, podendo representar um reservatório desconhecido dos mesmos 5,6. Tal pode representar um perigo para a saúde pública, dado que neste estado os microrganismos não serão detetados pelos métodos microbiológicos convencionais. No caso da segurança alimentar esta possível ameaça deveria ser considerada, tendo em conta que, quer os alimentos quer o processo da sua produção e acondicionamento, podem apresentar vários dos fatores de indução previamente mencionados. Outro fator importante é o facto do controlo biológico destes produtos ser ainda maioritariamente baseado na culturabilidade dos microrganismos. Um dos patogéneos importantes na segurança alimentar é Listeria monocytogenes. Este microrganismo é o único dentro do seu género, que engloba mais sete espécies, geralmente associado à ocorrência de listeriose humana. Esta doença apresenta sintomas deveras severos, com uma elevada taxa de mortalidade (cerca de 30%), principalmente nos grupos de risco determinados (adultos e jovens imunocomprometidos, grávidas, infantis e idosos). Apesar de uma baixa taxa de incidência, a severidade da doença derivou num nível zero de tolerância à sua presença nas amostras alimentares. Já foi igualmente reportada a entrada no estado VBNC e capacidade de reanimação por este patogéneo 22- 24 • Desta forma a presença do mesmo em produtos alimentares deveria contabilizar a existência de células VBNC de forma a assegurar a segurança dos consumidores. O objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de um método de diagnóstico baseado em PCR para a deteção de células VBNC de L. monocytogenes, com potencial de reanimação, em produtos alimentares. Este método deverá permitir a deteção da amplificação a partir de genes previamente escolhidos, fornecendo uma resposta específica, sensível e rápida, sendo que com a complementação com o reagente monoazida de propídio (PMA), os resultados obtidos corresponderão a células viáveis, dado que este inibe a amplificação a partir de células não viáveis. Os genes alvo definidos foram o Imo2522 e Imo0186, cujas proteínas serão potenciais Rpfs uma vez que apresentam características semelhantes às descritas para estes fatores. Seguidamente, foi efetuado uma pesquisa ("blast") da sequência das proteínas respetivas e, após a análise dos domínios das mesmas, foi efetuada uma comparação entre os alinhamentos preliminares das sequências em Listeria spp. e L. monocytogenes. A análise desta comparação permitiu verificar que ambas as sequências proteicas se apresentavam conservadas para o género Listeria, principalmente no caso de Lmo0186. Foram então definidas zonas para o posterior desenho de primers, de forma a obter uma amplificação específica para L. monocytogenes, as quais se baseavam numa região variável para Lm02522 e numa zona conservada que flanqueava uma zona variável em Lmo0186. Seguidamente, foram obtidas as sequências dos genes respeitantes a estas proteínas e realizado um alinhamento global por Clustal W, tendo sido obtidas as sequências consenso de ambos os genes. Estas foram utilizadas para o desenho de primers. Após o desenho dos pares de• primers, o potencial destes formarem estruturas secundárias foi analisado, após o que foi escolhido um par para cada gene e um para o controlo interno de amplificação (IAC) - GFP. Adicionalmente, e tendo em conta que existia a possibilidade de não ocorrer especificidade apenas para L. monocytogenes, foram incluídos primers para o gene hlyA cuja amplificação é específica para esta espécie. Tendo em conta que se pretendia uma reação em Multiplex-PCR, conduzindo à simultânea amplificação destes alvos, foi efetuado um Gradiente-PCR, o qual permitiu analisar a eficiência destes primers isoladamente, a diversas temperaturas de ligação, e definir a temperatura de 51,6oC para posteriores ensaios. Seguidamente, foram realizados ensaios para definir a especificidade e sensibilidade da reação. Para tal foram utilizadas amostras de DNA extraído através do método adaptado de Pitcher et aI. (1989)25. No ensaio de especificidade foram testadas seis espécies do género Listeria, incluindo mais do que uma estirpe para contabilizar a variabilidade intraespécie, bem como seis estirpes de E. coli. Os resultados revelaram que os primers Lmo2522 seriam específicos para L. monocytogenes, enquanto que os primers Lmo0186 seriam específicos para Listeria spp., uma vez que apenas L. grayii e L. seeligeri não apresentaram amplificação. Tal não foi considerado problemático, dado que a análise de resultados deveria ser efetuada juntamente com os resultados obtidos para a amplificação de hlyA. Seguidamente foi realizado o ensaio de sensibilidade, usando concentrações de DNA continuamente decrescentes, até 10 pg. Observou-se que até à concentração de 50 pg todos os produtos de amplificação eram distinguíveis o que não se verificava nas concentrações menores, pelo que este seria o limite de deteção da reação Multiplex-PCR. Foram igualmente realizados estes ensaios com cada par de primers isoladamente, tendo-se verificado limites de deteção de 5 pg para HlyA e 0,5 pg para Lmo2522 e Lmo0186, indicando uma diminuição de sensibilidade quando em Multiplex-PCR de 10x e 100x, respetivamente. o próximo passo foi a aplicação da reação Multiplex-PCR a DNA extraído a partir de culturas com concentrações de células progressivamente menores. O método de Pitcher et al. (1989)25 apesar de providenciar amostras de DNA muito puro, é laborioso e dispendioso. Tratando-se de um método de diagnóstico pretendia-se um método rápido, fácil de realizar e de baixo custo. Adicionalmente, o método a aplicar deveria apresentar elevada eficiência, tendo em conta que o mesmo deveria permitir uma extração de DNA suficiente para amplificação mesmo a partir de apenas algumas células. Este parâmetro seria crucial para o sucesso do protocolo uma vez que este seria aplicado para deteção direta de células VBNC em produtos alimentares, e como tal dependeria apenas da quantidade de células inicialmente presentes nesses produtos. Desta forma procedeu-se ao desenvolvimento de um protocolo de obtenção de DNA, tendo sido iniciados os ensaios com o método de lise das células por fervura. Estes ensaios demonstraram que este método conduzia a elevada variabilidade na quantidade de DNA obtido, independentemente da estirpe. Adicionalmente, verificou-se a existência de substâncias inibidoras na reação de PCR, tendo ocorrido a ausência de amplificação do IAC. Estes efeitos poderiam ser ligeiramente reduzidos pelo aumento da concentração de BSA na reação de PCR ou pela diluição das amostras, sendo que, no entanto, nenhum destes procedimentos, e outros testados para remoção dos detritos e proteínas, resultaram numa melhoria evidente da amplificação pretendida. Duas hipóteses foram colocadas para justificar a ausência de amplificação: inibição por excesso de DNA ou uma lise celular ineficiente com consequente baixa libertação de DNA. Para averiguar estas hipóteses foram sujeitas a lise suspensões com diferentes números de células, bem como o aumento da amostra aplicada no tubo de PCR. Os resultados mostraram que a lise celular era ineficiente resultando numa baixa concentração de DNA. Para aumentar a eficiência deste passo, foi efetuada a preparação das células numa solução de lise, TE+O,5% SDS, que pela ação do detergente aniónico poderia auxiliar na lise celular. O ensaio foi realizado nas mesmas condições anteriores, tendo sido obtidos os mesmos resultados negativos e demonstrando que o método se mantinha ineficiente. Para aumentar a referida eficiência de lise celular foi realizado um protocolo baseado na disrupção mecânica das células com microesferas de vidro na presença da solução de lise acima mencionada. Foram testadas duas suspensões correspondendo a aproximadamente 107 e 108 cfu. No entanto, foi apenas detetada amplificação do produto dos primers Lmo0186 ao testar a amostra obtida por diluição decimal, ocorrendo uma ausência completa de amplificação, incluindo do IAC, a partir das amostras originais. A inibição de amplificação foi atribuída, maioritariamente, à presença de substâncias inibidoras, dado que ambas as amostras apresentavam resultados semelhantes, o que não seria expectável considerando as diferenças no número de células utilizadas. Estes ensaios indicaram que a precipitação de DNA seria necessária, de modo a retirar quaisquer substâncias inibidoras das amostras. Tendo em conta que este passo iria aumentar a recuperação do DNA extraído, foi utilizado como método de lise o mais simples, a fervura das células, na presença de TE+2% SDS. Os resultados obtidos a partir de três amostras com cerca de 104 , 106 e 108 cfu, revelaram que a amplificação apenas era detetável a partir da suspensão mais concentrada, indicando uma baixa concentração de DNA nas amostras com menor número de células. No entanto, tendo em conta que o SDS na reação poderia igualmente influenciar os resultados através da inibição da reação, também este efeito foi averiguado . Sendo assim foram utilizadas duas soluções de lise: TE+O,5% SDS e TE+2% SDS+10% Tripton X-100 como uma solução de lise mais forte. Os resultados mostraram que a solução de lise mais fraca não seria suficiente, uma vez que apenas ocorreu amplificação com a solução de lise mais forte, e apenas na amostra de maior concentração celular. Tendo em conta que este novo protocolo se apresentava mais eficiente que os anteriormente utilizados, mas ainda ineficaz para a extração a partir de amostras de menor concentração celular, foi realizada uma otimização ao nível da precipitação de DNA. Para tal testou-se o efeito da incubação em gelo, durante 1 h, seguida de uma centrifugação de 15 ou 30 min a 4oC, Os resultados demonstraram que a incubação em gelo permitia uma melhor recuperação do DNA libertado no decorrer da extração e que maior período de centrifugação não estava associado a maior rendimento de DNA. No entanto, apesar de ocorrer uma melhor recuperação de DNA com estas alterações, as mesmas não permitiam ainda a amplificação a partir de amostras de menores concentrações celulares, tendo sido então o protocolo alterado para uma lise mecânica com microesferas. Para auxiliar o processo foram utilizadas as duas soluções de lise com melhores resultados, no entanto, ambos os protocolos utilizados apenas apresentaram resultados positivos nas amostras de maiores concentrações celulares (cerca de 108 cfu). Para aumentar a eficiência do método o tempo de agitação foi aumentado para 20 min e foi ainda adicionado o reagente GES, cujo efeito desproteinizante poderia auxiliar no processo de lise. Para manter elevada a eficiência do método foi ainda efetuada uma comparação de ambas as soluções de lise, de modo a evitar qualquer possível efeito inibitório das mesmas, tendo sido escolhida como solução de lise o TE+2% SDS. Neste ponto a eficiência da lise e precipitação do DNA era já bastante elevada, pelo que não se justificava uma contínua ausência da amplificação das amostras de menores concentrações celulares, sendo tal atribuível à baixa sensibilidade da reação do Multiplex-PCR. De modo a aumentar a mesma foram realizadas tentativas de otimização ao nível da concentração de MgCI2, da concentração dos primers e ainda do tempo de ligação dos primers. As melhores condições detetadas foram a concentração de 0,4 pmol/L e o tempo de ligação de 1 min, mantendo -se a concentração de MgCI2 inicialmente utilizada de 3 mM. Estas otimizações, apesar de apresentarem algumas melhorias face às anteriormente utilizadas, não conduziram ao aumento pretendido da sensibilidade do Multiplex-PCR. Sendo assim uma nova estratégia foi iniciada baseada na amplificação utilizando os pares de primers individualmente em cada reação. Foram efetuados ensaios para averiguar se, após estas alterações, a sensibilidade destes pares se mantinha e se estes seriam capazes de detetar baixas concentrações de DNA. Todos os pares permitiam amplificação a partir de amostras celulares com 102 cfu, sendo que a amplificação com Lmo0186 era mais facilmente visível em gel. Desta forma este par foi novamente sujeito a ensaios de sensibilidade, quer com DNA stock, quer com DNA extraído com o método desenvolvido. Os resultados revelaram um limite de deteção de 125 fg de DNA, e uma capacidade de amplificação a partir de amostras de concentrações celulares muito baixas, 10 e 1 cfu. Os mesmos resultados foram obtidos com amostras de células VBNC, revelando a eficiência do método. Seguidamente foi adicionado a esta reação o IAC, o qual será necessário para a validação dos possíveis resultados negativos provenientes de amostras alimentares. Para tal foi necessário determinar a concentração do plasmídeo pCambia 1302, contendo o gene gfp, na qual a amplificação do gene alvo não seria prejudicada. Foi escolhida inicialmente a concentração de 350 fg, no entanto esta levou a uma diminuição na eficiência da amplificação do gene alvo. Uma vez que a diminuição da concentração do plasmídeo para 3,5 fg obteve os mesmos resultados, um equilíbrio seria necessário de forma a que a amplificação do gene alvo não fosse lesada. Diversas concentrações de plasmídeo foram testadas, tendo-se verificado que para valores inferiores a 90 fg ocorria uma maior inibição da reação. As concentrações com melhores resultados foram os 350 e 175 fg. Para contornar o efeito negativo na amplificação do gene alvo, foi efetuado o aumento do volume da amostra de DNA no tubo de PCR, tendo-se verificado que seria necessário um aumento de 5x, correspondendo a cerca de 250 fg. Adicionalmente foram realizados os ensaios com PMA. Estes demostraram que este reagente tem a capacidade de impedir a amplificação de DNA proveniente de células não viáveis, sendo apenas detetável a amplificação do DNA proveniente de células ainda viáveis. A aplicação deste reagente a suspensões de células VBNC, com diferentes concentrações, permitiu verificar que a amplificação a partir apenas de células viáveis incluindo VBNC era possível, verificando-se igualmente que a intensidade de amplificação era relativamente inferior à observada em ensaios anteriores ao usar as mesmas suspensões para deteção de células totais. Esta observação era mais evidente na amplificação correspondente às suspensões com maior concentração celular, relevando uma maior ocorrência de células não viáveis. A fase final deste trabalho consistiu na aplicação do método desenvolvido em amostras de queijo artificialmente contaminadas com L. monocytogenes. Nos ensaios realizados foi verificado que a matriz alimentar apresentava uma forte influência no resultado da amplificação, reduzindo o limite de deteção. Foi igualmente verificada a ocorrência de amplificação não específica, a qual poderia derivar de microrganismos presentes ou da própria matriz alimentar. De forma a atribuir a amplificação inespecífica foi efetuado uma pesquisa, através do NCBI, da sequência dos primers. Segundo as informações obtidas, uma das complementaridades possíveis corresponderia a 80S taurus, sendo que, no entanto, o tamanho previsto de amplificação não correspondia aos verificados. Não obstante, a amplificação inespecífica era distinguível da pretendida e como tal não foram efetuadas mais análises neste sentido. Os resultados dos ensaios efetuados revelaram que a amplificação era detetada até à concentração de 104 cfu em culturas overnight e 106 células nas suspensões de indução de células VBNC. A diminuição da deteção a partir das amostras de queijo poderia ser atribuível quer ao aumento da entropia durante a extração de DNA, derivado da presença de outros microrganismos bem como da própria matriz alimentar, quer ao esgotamento dos reagentes da reação de PCR, nomeadamente primers, pela amplificação inespecífica detetada. Para averiguar esta última hipótese, as amostras foram sujeitas a maiores temperaturas de ligação, para aumentar a restringência da reação, tendo sido igualmente testado o efeito do aumento da concentração dos primers para 0,8 e 1 pnp1J/ Embora um aumento de sinal de amplificação fosse visível, as alterações não conduziram ao desaparecimento da amplificação inespecífica nem a uma alteração do limite de deteção nas amostras. Sendo assim, foi considerado que a melhor estratégia seria a remoção da matriz alimentar antes da realização do protocolo de extração de DNA através da realização de diferentes centrifugações, que permitissem a separação inicial da matriz alimentar das células bacterianas e seguidamente a recolha destas para posterior extração de DNA. Outra alternativa testada foi a utilização de uma matriz alimentar diferente: folhas de rúcula. Os ensaios realizados com estas amostras e procedimentos, revelaram uma amplificação apenas detetável nas amostras inoculadas com suspensões celulares com 106 cfu, indicando uma recuperação ineficiente das células. Não se observou amplificação inespecífica mas é necessário otimizar a recolha das células a partir deste tipo de alimento. Paralelamente a este trabalho foi ainda efetuada a análise do período de indução necessário para a perda de culturabilidade de suspensões com diferentes concentrações celulares nos mesmos meios de indução de VBNC. As concentrações celulares analisadas foram 106 , 104 , 102 , 10 e 1 cfu/mL. Verificou-se que, nas suspensões de maior concentração celular, a indução poderia demorar mais de um ano, sendo que à data do término desta tese algumas suspensões mantinham-se ainda cultiváveis. Relativamente às restantes concentrações celulares, verificou-se que os tempos necessários para a indução eram relativamente menores. Na concentração de 104 cfu/mL a perda de culturabilidade, em TSA, variava entre o 140 e 990 dia e para as suspensões de 102 cfu/mL apenas seriam necessários cerca de 9 a 40 dias. Foi verificado que nas suspensões de menores concentrações celulares (10 e 1 cfu/mL) o tempo de indução era bastante semelhante ao verificado para as suspensões de 102 cfu/mL, e que nas concentrações de 104 e 102 cfu/mL a persistência de células injuriadas, detetadas pela culturabilidade em TSA+SP, era muito prolongada, com máximos detetados de 170 e 127 dias respetivamente, o que não ocorria nas concentrações de 10 e 1 cfu/mL. Tais observações levantam a hipótese de existir algum mecanismo de controlo de indução, mediante a concentração celular, subjacente. Atualmente estão a decorrer novos ensaios e após a análise de todos os dados espera-se poder compreender um pouco melhor o processo de indução de células de VBNC em L. monocytogenes.Chambel, Lélia Mariana Marcão, 1964-Repositório da Universidade de LisboaCosta, Olívia Carina Campos da, 1983-2013-04-03T16:14:04Z20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/8202enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:51:56Zoai:repositorio.ul.pt:10451/8202Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:32:49.017311Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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