Drug repurposing against malaria parasites

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Moules, Isabel Margarida Meneses
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/53916
Resumo: Tese de mestrado, Microbiologia Clínica e Doenças Infecciosas Emergentes, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2021
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spelling Drug repurposing against malaria parasitesMaláriaMonitorização de fármacosReposicionamento de fármacosFase-hepáticaPlaca de 384-poçosTeses de mestrado - 2021Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Microbiologia Clínica e Doenças Infecciosas Emergentes, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2021A malária é uma doença infeciosa causada por parasitas do género Plasmodium, que são transmitidos através da picada de um mosquito fêmea do género Anopheles. Ao longo do tempo muitos esforços têm vindo a ser desenvolvidos para combater a malária, mas esta ainda é uma das doenças infeciosas mais prevalentes a nível global, sendo que, a região africana é a que apresenta a maior taxa de mortalidade. Esta doença infeciosa afeta centenas de milhões de pessoas anualmente, e as crianças abaixo dos cinco anos de idade são o grupo mais vulnerável. Existem 6 espécies de parasitas capazes de causar a doença em seres humanos, P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. knowlesi, P. malariae e P. simium, sendo que os três primeiros constituem a maior ameaça. O P. falciparum por estar associado ao maior número de mortes relatadas e o P. vivax por ter a capacidade de gerar hipnozoítos, uma forma dormente que tem a capacidade de permanecer no fígado do hospedeiro durante meses, ou até mesmo anos, podendo causar recidivas. O ciclo de vida do Plasmodium no ser humano divide-se em duas fases: a hepática e a sanguínea, sendo que a segunda é caracterizada pelo aparecimento dos sintomas da doença. A fase hepática é caracterizada por ter uma natureza obrigatória e clinicamente silenciosa. Tendo em conta estas características, e dado o número relativamente baixo de parasitas que infecta o fígado, bem como a existência de espécies, o P. vivax e o P. ovale, capazes de gerar hipnozoítos, esta fase constitui o alvo ideal para o desenvolvimento de novos medicamentos profiláticos. No entanto, o número de fármacos que atuam na fase hepática do ciclo de vida do parasita é limitado, quando comparado com a fase sanguínea, possivelmente devido às dificuldades persistentes em estudar a fase hepática experimentalmente. Contra a infeção da fase hepática do ciclo de vida do Plasmodium destacam-se a primaquina, atovaquona-proguanil (malarone) e tafenoquina, sendo que apenas o primeiro demonstrou ser eficaz contra as formas dormentes causadas por P. vivax e P. ovale. Contudo, a primaquina pode causar complicações severas como a anemia hemolítica, especialmente perigosa podendo ser até mesmo letal para pessoas que apresentem deficiência na glucose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD), uma mutação muito comum em áreas onde a malária é endémica. Ao longo dos tempos, vários esforços têm vindo a ser realizados e desenvolvidos no controlo da malária, e na descoberta de novas terapêuticas eficazes contra a infeção por Plasmodium. No entanto, o desenvolvimento de novos fármacos é frequentemente um processo moroso e dispendioso. De forma a ultrapassar todas as barreiras impostas pelo desenvolvimento de fármacos de novo e de atender à falta de opções de profilaxia surge o reposicionamento de fármacos. A utilização desta abordagem surge como uma estratégia alternativa, menos morosa e dispendiosa, uma vez que se destina à avaliação de fármacos já existentes e aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento de outras doenças. Esta tese tem como objetivo primordial o estabelecimento e otimização de uma plataforma de alto rendimento para a monitorização da atividade de fármacos contra a fase hepática da infeção por Plasmodium. No laboratório, os fármacos são testados através da utilização de placas de 96 poços. No entanto, e de modo a aumentar o número de fármacos a serem testados simultaneamente, reduzir na quantidade de reagentes utilizados nestes ensaios e de esporozoítos, que são um fator limitante, procedeu-se à otimização e implementação das placas de 384 poços. O processo de otimização envolveu a avaliação e análise de diversos parâmetros, nomeadamente: 1) a avaliação do número de células a utilizar por poço, tendo sido testadas 2000 e 3000 células por poço; 2) a monitorização da evaporação (edge effect) nas últimas linhas e colunas da placa de 384 poços; 3) a avaliação de diferentes volumes e condições, nomeadamente 30 µL com e sem remoção do meio e 60 µL; 4) a avaliação de diferentes números de esporozoítos por poço, em que foram testados números 2000 e 4000 esporozoítos por poço e por fim 5) a determinação dos valores de IC50 de fármacos, primaquina, atovaquona e ivermectina, habitualmente utlizados na profilaxia e/ou tratamento da malária. Através da otimização das placas de 384 poços mostrámos que podem ser utilizados números de esporozoítos tão reduzidos como 2000 esporozoítos por poço, isto sem comprometer a deteção de infeção. Além disso, e através das experiências de determinação dos valores de IC50, mostrámos que os valores obtidos através da utilização das placas de 384 poços para fármacos comummente utilizados na profilaxia e/ou tratamento da malária (primaquina, atovaquona e ivermectina). Para além da otimização e implementação das placas de 384 poços, e tendo em conta, que a sobreposição geográfica existente entre a tuberculose e a malária ocorre essencialmente na África Subsariana, onde também existem outras doenças tropicais negligenciadas, como a fasciolíase hepática, na presente tese, foram selecionados trinta e cinco medicamentos anti infeciosos que são terapeuticamente relevantes e de interesse. Considerando, que as doenças não-transmissíveis também afetam os países em desenvolvimento, foram ainda selecionados sete fármacos de outras classes, de acordo com a Lista de Medicamentos Essenciais (LME) da Organização Mundial de Saúde (OMS). A utilização da LME da OMS para a seleção dos fármacos a testar é particularmente interessante uma vez que permite a identificação de fármacos que são ativos contra doenças infeciosas que afetam regiões mais pobres do globo, que têm uma sobreposição geográfica com a malária, e que já são utilizados em campo sendo, portanto, acessíveis a toda a população. No entanto, e apesar de grande parte dos fármacos selecionados para serem testados nesta tese serem utilizados no combate das doenças infeciosas, a LME também inclui um grande número de fármacos utilizados contra doenças crónicas o que nos levou à seleção da carbamazepina, sinvastatina, triclabendazol e o omeprazol. Os resultados obtidos após as primeiras experiências de monitorização dos trinta e oito fármacos permitiram a seleção de dois fármacos: a bedaquilina e o triclabendazol. A bedaquilina é utilizada no tratamento de tuberculose multirresistente. E o triclabendazol utilizado no tratamento da fasciolíase. As determinações de IC50, efetuadas através da utilização de placas de 96 poços, permitiram a determinação dos seguintes valores 6.95 ± 0.84 µM para a bedaquilina e 4.58 ± 0.91 µM para o triclabendazol. Até à data, não havia na literatura informação acerca da atividade da bedaquilina contra a fase hepática de P. berghei. Através das experiências de análise de citometria de fluxo realizadas nesta tese, mostrou-se pela primeira vez que a bedaquilina não afetou a invasão dos hepatócitos pelo P. berghei, mas sim o seu desenvolvimento nos mesmos. Os resultados obtidos nesta tese sugerem que a bedaquilina pode ser utilizado como medicamento profilático em zonas onde a tuberculose e malária são co endémicas. O triclabendazol também mostrou uma atividade interessante contra a infeção da fase hepática por P. berghei e que merece ser melhor estudado futuramente. Tendo em conta a sobreposição geográfica existente entre a tuberculose e a malária, os resultados obtidos nesta tese podem fornecer novas abordagens e aplicações da bedaquilina e outros fármacos como agentes profiláticos. Em estudos futuros, os fármacos que mostraram ter atividade promissora in vitro contra a fase hepática de P. berghei devem ser testados in vivo contra a fase hepática de P.berghei e in vitro contra a fase sanguínea de P. falciparum. Estes estudos, confirmariam o seu potencial como agentes profiláticos, bem como opções de tratamento.Malaria is an infectious disease caused by Plasmodium parasites, which are transmitted to their mammalian host by infected female Anopheles mosquitoes. The obligatory and silent nature of the liver stage of the parasite’s life cycle in the mammalian host makes it an ideal target for the development of new prophylactic drugs. However, and despite efforts towards malaria control and discovery of efficient therapies, the development of new drugs is a challenging, highly expensive and time-consuming process. Drug repurposing appears as an alternative strategy to overcome the barriers imposed by de novo drug development. This thesis aims at the establishment and optimization of a high-throughput drug screening platform aimed at maximizing throughput, while reducing the amount of reagents and parasites employed in screening assays aimed at identifying drugs with activity against Plasmodium hepatic infection. Following an optimization process, we showed that amounts as low as 2000 sporozoites per well can be employed without compromising the detection of infection. Moreover, the IC50 values obtained employing a 384-well plate format to evaluate the activity of standard anti-plasmodial drugs are in agreement with the ones described in the literature, validating the use of this system for drug screening purposes. In addition, the antiplasmodial activity of 31 anti-infective compounds therapeutically relevant for diseases that geographically overlap with malaria was assessed. Considering that non-communicable diseases also affect developing countries, an additional 7 compounds of other classes were selected from the World Health Organization (WHO) Essential Medicines List for these assays. The IC50 values of bedaquiline, a tuberculostatic drug, and triclabendazole, an antihelminthic drug, were determined to be 6.95±0.84 µM and 4,58±0,91 µM, respectively. The flow cytometry analysis revealed that bedaquiline did not affect the invasion of hepatocytes by the parasites, but rather impacted their intra-hepatic development. The antiplasmodial activity observed confirms the potential of such medicines to be repurposed against Plasmodium parasites and encourages further drug screening efforts of various compound classes.Fontinha, Diana Marisa Pinto FreirePrudêncio, MiguelRepositório da Universidade de LisboaMoules, Isabel Margarida Meneses2022-07-22T14:06:23Z2022-02-242022-02-24T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/53916TID:202948773enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:00:11Zoai:repositorio.ul.pt:10451/53916Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:04:54.896440Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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