3- Dimensional characterization of PanIN (Pancreatic Intraepithelial neoplasia) in cleared human pancreatic cancer tissues by multiplex immunofluorescence

• Autor(a) principal: DIAS, Susana Canastra
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/116424
• topic: Ciências biomédicas; Microbiologia médica; Biologia molecular; Adenocarcinoma do pâncreas; Neoplasia intraepitelial pancreática; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas

O adenocarcinoma pancreático (PDAC) é uma das neoplasias com maior taxa de mortalidade devido à ausência de métodos de deteção precoce e terapêuticas eficazes, levando à sua deteção numa fase avançada e não-tratável da doença. A sua carcinogénese é explicada através da acumulação de alterações moleculares, numa das três lesões percursoras, neoplasia cística mucinosa, neoplasia intraductal papilar mucinosa e neoplasia intraepitelial pancreatica (PanIN). A PanIN é a lesão percursora mais frequente, caracterizada como uma proliferação epitelial não invasiva, que apresenta vários graus de displasia histológica, refletindo as alterações moleculares existentes nas diferentes fases, afetando os genes K-RAS, P16, TP53, SMAD4, entre outros. A histologia é o gold standard para o estudo de amostras, seus componentes e relação anatómica, através do corte das amostras em fatias finas, fornecendo apenas uma perspetiva bidimensional da amostra, que é limitante e que enviesa a perceção e o estudo da tridimensionalidade dos tecidos, em condições normais e patológicas. De forma a permitir o estudo tridimensional das amostras e evitar os artefactos dados pela reconstituição sequencial de fatias finas têm sido desenvolvidas as técnicas de clearing, que através da redução da opacidade dos tecidos, pela homogeneização dos índices refrativos dos vários constituintes celulares, reduzem a dispersão da luz e permitem a sua penetração. Várias são as técnicas até agora descritas, que se agrupam, consoante o reagente usado, em aquosas ou solventes orgânicos, sendo este último grupo mais eficaz em tecidos fibróticos, como os tecidos cancerígenos. Para a caracterização dos tecidos humanos são necessárias técnicas de imunofluorescência, no entanto a penetração máxima dos anticorpos, até agora descrita para blocos de parafina com PDAC, é de 0.6 mm, devido ao seu elevado conteúdo fibrótico. O presente trabalho teve como objetivo a otimização das técnicas de imunofluorescência aplicadas a tecidos espessos com PDAC, assim como, o estudo da relação anatómica entre os vários graus de PanIN e o PDAC. Para isso foram utilizados cinco blocos de parafina do arquivo do Centro Clínico da Fundação Champalimaud, com 2 mm de espessura, corados através de imunofluorescência com anticorpos anti-citoqueratina 19, anti-AGR2 e anti-p53. A otimização das técnicas de imunofluorescência, aplicadas a amostras espessas, foi feita através da introdução de um passo de recuperação antigénica, digestão enzimática e extensão do tempo de incubação do anticorpo, assim como, um aumento da quantidade de anticorpo por amostra, o que permitiu a visualização das amostras em toda a sua extensão. Todas as marcações citoplasmáticas foram desenvolvidas com êxito, no entanto não foi possível identificar marcação nuclear. Através da análise das amostras branqueadas, coradas com anticorpos anti-citoqueratina 19 e anti-AGR2, foi possível identificar ductos normais, ductos com PanIN e células cancerígenas, no entanto, trabalho adicional é necessário para estabelecer parâmetros de correlação das características apresentadas pelos ductos com PanIN, em amostras branqueadas espessas, com a classificação histológica. A nível anatómico, identifica-se uma tendência para as células cancerígenas se desenvolverem e localizarem junto das ramificações ductais e não perto dos ductos de maior calibre