Effect of pulsed electric fields on cell viability and metabolism

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Caldeira, Viviana Modesto
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.21/16383
Resumo: Mestrado em Engenharia Biomédica
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spelling Effect of pulsed electric fields on cell viability and metabolismPotência pulsadaCampos elétricos pulsadosEletroporaçãoEstado metabólicoCell culturePulsed powerPulsed electric fieldsElectroporationMetabolic stateMestrado em Engenharia BiomédicaABSTRACT - Pulsed Power (PP) is used in industry and biotechnology research due to its high voltage singularities. In biological systems, electroporation based on Pulsed Electric Fields (PEF) is an effective way of energy delivery, allowing controlled pulses with specific electrical parameters. Electroporation is the name given to the phenomenon where occurs permeabilization of the plasma membrane and this process could be reversible or irreversible. PEF on mammalian cells promotes diverse biological processes based on non-ligand agonists, that bypass receptors at the plasma membrane while inducting diverse intracellular signalling pathways. The final biological effect will depend on the quantity and type of the targeted cells and PEF conditions and can be as diverse as the enhancement of cells proliferation capacity or in opposition, cell death. The main goal of this experimental work, based on in vitro techniques using a fibroblast L929 cell line, was to evaluate three different conditions under PEF applications that may influence fibroblast metabolism. Firstly, the impact of electric fields magnitude (between 10 and 15kV/cm) with different pulses, secondly the effect of different fibroblasts concentration on the assay (between 50,000 to 1500 x103 cells per 800μL of Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline - DPBS) and finally to evaluate the effect of repeated PEF applications (between 1 to 3 repetitions) on cells viability and proliferative capacity. To achieve the latter, three experiments were designed. The first experiment evaluated the impact of PEF on cell viability immediately, at 48 hours, and at 72 hours after the assay. The second experiment studied the influence of cell density and its interference on the electric field applied, cell lysis, and on cell viability immediately and 72 hours after the assay. The third experiment entails three assays that assessed the weight of applying consecutively PEF with 48 hours intervals on different cell density samples and the maintenance of cell viability upon each application – immediately, at 48 hours, and 96 hours after the assay. The specific energy (Ws) and temperature increase (ΔT) of each biological sample were calculated after each experiment to guarantee that was no cell overheating. The DPBS used as a conductive solution, the cell pellet and the culture medium of all samples after PEF application were submitted to Fourier Transformed Infrared (FTIR) spectroscopy, the data obtained was then processed by Unscrumbler X software and submitted to Principal Component Analysis (PCA). Regarding cell count and cell viability common statistical analysis (average and standard deviation) and Analysis of Variance – ANOVA – single factor evaluation was performed. The data obtained demonstrates that a high electric field (15kV/cm with 1 pulse) promoted almost whole cell lysis, representing non-thermal irreversible electroporation (NTIRE), whereas the lowest electric field (10kV/cm with 2 pulses or 10 pulses) did not affect with statical significance cell viability. In addition, the lowest field with 5 pulses (10kV/cm with 5 pulses) was the most promising since the cells showed acceptable FTIR spectroscopy signals without major effects on initial cell viability. Moreover, it was observed that larger cell densities during PEF application guarantee higher cell viability, being the ideal number between 1,500x103 and 500x103 cells per 800μL of the assay. Furthermore, the repeated application of PEF in fibroblasts affected cell viability, being acceptable for one or two repetitions with intervals not inferior to 48h between applications. According to statistical data the assays are verifiable and reproducible, but in the future, more control samples are needed. This work confirms the potential of PEF in mammalian cell research, since it avoids overheating in living matter, showing that further studies are needed, in this area.RESUMO - A Potência Pulsada (PP) é amplamente usada na indústria e também em investigação biotecnológica devido às suas singularidades de alta tensão. Em sistemas biológicos, a eletroporação baseada em Campos Elétricos Pulsados (CEP) é uma forma eficaz de aplicar energia, permitindo pulsos controlados com parâmetros elétricos específicos. Eletroporação é o nome dado ao fenómeno onde ocorre uma permeabilização da membrana citoplasmática e este processo pode ser reversível ou irreversível. Os CEP em células animais promovem diversos processos biológicos baseados em agonistas não ligantes, que contornam os recetores na membrana plasmática enquanto induzem diversas vias de sinalização intracelular. O efeito biológico final dependerá da quantidade e tipo de células-alvo e das condições do campo elétrico pulsado e pode ser tão distinto quanto o aumento da capacidade da proliferação celular ou, pelo contrário, a morte celular. O principal objetivo deste trabalho experimental, baseado em técnicas in vitro utilizando a linha celular de fibroblastos L929, foi avaliar três condições diferentes com aplicações de CEP que podem influenciar o metabolismo dos fibroblastos. Primeiro, foi avaliado o impacto dos campos elétricos (entre 10 e 15kV/cm) com diferentes impulsos, seguidamente, o efeito de diferentes concentrações de fibroblastos no ensaio (entre 50000 a 1500x103 células por 800μL de Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline Dulbecco - DPBS) e, finalmente o efeito de aplicações repetidas de PEF (entre 1 a 3 repetições) na viabilidade e capacidade proliferativa das células. Para isto, desenharam-se três experiências. A primeira experiência avaliou o impacto do CEP na viabilidade celular imediatamente, 48 horas e 72 horas após o ensaio. A segunda experiência estudou a influência da densidade celular e sua interferência no campo elétrico aplicado, na lise celular e na viabilidade celular imediatamente e 72 horas após o ensaio. A terceira experiência envolve três ensaios que avaliaram o impacto da aplicação consecutiva de CEP com intervalos de 48 horas em diferentes amostras de densidade celular e a manutenção da viabilidade celular em cada aplicação - imediatamente, 48 horas e 96 horas após o ensaio. A energia específica (Ws) e o aumento da temperatura (ΔT) de cada amostra biológica foram calculados após cada experiência para garantir a ausência de sobreaquecimento celular. O DPBS utilizado como solução condutora, o pellet celular e o meio de cultura de todas as amostras após a aplicação do PEF foram submetidos à espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), os dados obtidos foram então processados pelo software Unscrumbler X e submetidos a Análise de Componentes Principais (PCA). Em relação à contagem e viabilidade celular, foram realizadas, estatística comum (média e desvio padrão) e análise de variância - ANOVA - single factor evaluation. Os dados obtidos demonstraram que, um campo elétrico elevado (15kV/cm com 1 impulso) promoveu quase por completo a lise celular, representando uma eletroporação não térmica irreversível (NTIRE) e o menor campo elétrico (10kV/cm com 2 impulsos e 10 impulsos) não afetou pertinentemente a viabilidade celular, mas ocorreu libertação de componentes intracelulares para o meio condutor. Consequentemente, o campo mais baixo (10kV/cm com 5 impulsos) foi o mais promissor, uma vez que as células mostraram sinais de espectroscopia FTIR aceitáveis sem grande impacto na viabilidade celular inicial. Além disso, observou-se ainda que um maior número de células tem um efeito relevante nas aplicações CEP, observando-se que maior densidade celular garante uma melhor viabilidade, sendo o número ideal entre 1500x103 e 500x103 (em 800μL de DPBS). A aplicação repetida de CEP em células animais também afeta a viabilidade celular, sendo aceitável uma ou duas repetições com intervalos não inferiores a 48h entre aplicações. De acordo com os dados estatísticos, os ensaios são verificáveis e reprodutíveis, mas no futuro, mais amostras de controlo serão necessárias. Este trabalho confirma o potencial do CEP na investigação em células animais, uma vez que evita o superaquecimento na matéria viva, mas revelando que mais estudos são necessários, nesta área.Instituto Politécnico de Lisboa, Escola Superior de Tecnologia da Saúde de LisboaRedondo, LuísCalado, Cecília Ribeiro da CruzRCIPLCaldeira, Viviana Modesto2023-08-22T11:13:26Z20202020-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.21/16383engCaldeira VM. Effect of pulsed electric fields on cell viability and metabolism [dissertation]. 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