Development of a new ultra-fast freezing procedure for zebrafish sperm cryopreservation

• Autor(a) principal: Rebocho, Sandra Raquel de Melo Vieira Martins
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.8/3260
• topic: criopreservação; fertilização in vitro; esperma; peixe-zebra; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia

À medida que novas linhas novas geneticamente modificadas vão sendo geradas, aumenta o desafio de manter este vasto número de peixes-zebra. Desta forma, a criopreservação de esperma tem sido considerada uma ótima opção para o armazenamento a longo prazo de material genético reduzindo assim custos inerentes à sua manutenção. Os métodos tradicionais de criopreservação e vitrificação são os mais utilizados para criopreservar células. A vitrificação apresenta inúmeras vantagens sobre o método tradicional, entre as quais a não formação de cristais de gelo através de elevadas taxas de arrefecimento. Desta forma, a concentração de agentes crioprotetores utilizados pode ser menor, diminuindo o seu efeito tóxico nas células. A falta de padronização e resultados coesos em estudos anteriores foram as principais razões para o desenvolvimento de um método simples e consistente na Plataforma de Peixes da Fundação Champalimaud. Desta forma, o objetivo principal desta tese foi o desenvolvimento de um protocolo fácil, económico e coerente, designado por congelamento ultra-rápido. Este método otimizado para a criopreservação de esperma de peixe-zebra terá um impacto muito importante na comunidade científica. De 23 protocolos testados (n = 201), foram escolhidos para criopreservação de esperma de peixe-zebra os que apresentaram melhores resultados tendo em conta a percentagem de recuperação de linhas, a taxa média de fertilização, a taxa média de sobrevivência das larvas e a taxa média de malformações. Desta forma, foram selecionados dois protocolos com combinações de extender e crioprotector distintas. Em relação aos métodos complementares utilizados na otimização do protocolo de criopreservação, a estimulação hormonal das fêmeas com 17α,20β-DHP traduziu-se claramente numa melhoria na qualidade e quantidade dos oócitos, sendo um passo muito importante na otimização deste protocolo; a quantificação da concentração de esperma é útil apenas com amostras translúcidas, no entanto indicou que a concentração de esperma não pode ser correlacionada com a taxa de fertilização; o protocolo otimizado de FIV (fertilização in vitro) é, no momento, um serviço prestado pela Plataforma de Peixes da Fundação Champalimaud. Paralelamente à otimização da criopreservação de esperma, foi otimizado um protocolo de transgénese usando o sistema de transposão Tol2 com microinjeção in vitro de oócitos seguido pela técnica de FIV otimizada anteriormente. Com este método, a percentagem de fundadores transgénicos de uma linha transgénica estável foi de 66.67%, muito superior à observada em microinjeção no estádio de zigoto. Foi ainda realizada uma análise da viabilidade do esperma em peixes alimentados com duas dietas comerciais (Skretting Gemma® e SparosZebrafeed®) tendo como conclusão que ambas as dietas são semelhantes.