Entrega direcionada às células dendríticas: Funcionalização de um vetor de DNA minicircular com ligandos

• Autor(a) principal: Serra, Ana Sofia Mota Martins
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.6/11488
• topic: Cancro do Colo do Útero; Manose; Péptido R8; Polietilenimina; Vacinas de Dna Minicircular; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Biotecnologia

O cancro é uma doença que continua a proliferar em todo o mundo, sendo uma das principais causas de mortalidade, porém a probabilidade de encontrar a cura tem vindo a aumentar em resultado dos vários estudos desenvolvidos ao longo dos últimos anos. O cancro do colo do útero é a doença mais relevante associada à infeção pelo vírus do papiloma humano (HPV), principalmente quando não é detetado precocemente, evoluindo para formas invasivas. A sobreexpressão das oncoproteínas HPV E6 e E7 interfere na regulação e proliferação do ciclo celular através do comprometimento das proteínas supressoras de tumor p53 e pRb, respetivamente. Embora a vacinação profilática contra o HPV seja atualmente a melhor estratégia para prevenir o cancro do colo do útero, esse tipo de vacina não é eficaz no tratamento de infeções pré-existentes. Para preencher essa lacuna, vários tipos de vacinas terapêuticas contra o HPV têm sido estudadas. As vacinas de DNA têm assumido particular importância devido à sua capacidade de gerar respostas imunes celulares e humorais, a partir do uso de sequências de material genético do patogénio que se pretende combater. O DNA minicircular (mcDNA) é uma molécula de DNA inovadora e promissora, uma vez que a ausência de sequências procarióticas supera algumas das principais limitações do DNA plasmídeo tradicional. O sucesso das vacinas de DNA está fortemente dependente do desenvolvimento de sistemas eficientes de entrega de genes que devem ser capazes de condensar e proteger o DNA, ligando-se à membrana e internalizando-se nas células eucarióticas, superando todos os obstáculos intracelulares e extracelulares. Os vetores virais oferecem alta eficiência de transfecção para células eucarióticas. No entanto, apresentam desvantagens significativas, como antigenicidade, potenciais efeitos oncogénicos, possível recombinação do vírus ou dificuldade de produção e armazenamento em larga escala. Para superar essas limitações, várias tentativas têm sido feitas para desenvolver sistemas de entrega de genes não virais baseados em lipossomas, polímeros catiónicos sintéticos ou naturais e péptidos de penetração celular (CPPs). A polietilenimina (PEI) é o polímero catiónico sintético mais utilizado, existindo em diversos pesos moleculares e estruturas lineares ou ramificadas. A abundância de aminas favorece a formulação de sistemas de entrega PEI/DNA com elevada carga superficial, o que melhora a eficiência da transfecção, mas também aumenta a toxicidade. A conjugação de PEI com outras moléculas é uma abordagem possível para reduzir a toxicidade. Para aumentar a eficiência das vacinas de DNA, várias estratégias têm-se concentrado no direcionamento de células apresentadoras de antigénios (APCs). O desenvolvimento de novas formulações contendo ligandos específicos para direcionar e entregar vacinas de DNA em APCs tem sido explorado. Neste contexto, os ligandos de manose são frequentemente usados para ligar a recetores de manose que são altamente expressos em superfícies de DC e macrófagos. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de novos sistemas binários e ternários, baseados no polímero PEI, no péptido R8 e em ligandos de manose, para entrega direcionada de uma vacina de mcDNA às APCs. Os sistemas foram formulados com vários rácios N/P (relação entre grupos amina e grupos fosfato) e as suas propriedades estruturais, físico-químicas e de estabilidade foram estudadas, a fim de identificar o sistema de entrega mais eficiente. Para avaliar a captação e internalização celular bem como a eficiência de transfeção destes sistemas, foram realizados ensaios de transfeção in vitro com diferentes linhas celulares. Os resultados obtidos neste trabalho revelam que a elevada densidade de carga e capacidade de condensação do PEI e R8 aumentam a interação com o mcDNA, levando à formação de partículas menores. A adição do polímero PEI ao sistema binário R8-manose/mcDNA não só reduz o tamanho como também aumenta o potencial zeta e a estabilidade do sistema. Os estudos de microscopia de fluorescência confocal confirmaram a localização intracelular de sistemas de direcionamento, resultando na captação sustentada de mcDNA. Além disso, a eficiência da transfecção in vitro pode ser influenciada pela presença de R8-manose, com grandes implicações para a expressão génica. Os sistemas ternários R8- manose/PEI/mcDNA podem ser considerados ferramentas valiosas para instigar novas pesquisas, visando avanços no campo das vacinas de DNA.