Lineage development of cell fusion hybrids upon somatic reprogramming

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Frade, João Manuel Rodrigues, 1988
Data de Publicação: 2011
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/6362
Resumo: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
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spelling Lineage development of cell fusion hybrids upon somatic reprogrammingCélulas estaminaisFusão celularRegeneraçãoTeses de mestrado - 2011Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Somatic cell reprogramming has been extensively studied over the last years and opened new perspectives in the use of pluripotent cells for regenerative biomedical purposes. Spontaneous cell fusion has been suggested to be involved in regenerative processes in vivo. Strong evidences support the hypothesis that the reprogrammed hybrids resulting from the fusion between a pluripotent cell and a somatic cell exhibit pluripotent characteristics and may provide a source for cell therapy in the future. Previous evidences show that tetraploid hybrid cells are originated after the fusion event and that both in vitro and in vivo these cells can give rise to diploid cells by mitotic processes that are not fully understood. This “ploidy reduction” is the focus of this project. The fate of the hybrid cells was characterized by addressing the karyotype of the reprogrammed cells originated after fusion between Embryonic Stem cells and multipotent Neural Stem cells. We identified stable tetraploid and diploid clones that resisted the selection system after fusion and exhibit pluripotent characteristics. Furthermore, we showed that the obtained diploid cells have a fusion origin and are not a result of transdifferentiation or resistant Embryonic Stem cells. This study shows that ploidy reduction could be a consequence of fusion-mediated reprogramming corroborating the results published by other research group. We hypothesize that fusion-derived diploid cells might have been ignored in other studies or confounded with transdifferentiation events. The characterization of ploidy reduction is important to understand the role of cell fusion-mediated reprogramming during tissue regeneration and to uncover how these hybrids proliferate to eventually repopulate the damaged area.O desenvolvimento de um organismo desde a fecundação do óvulo até à formação de um organismo adulto foi durante muito tempo considerado um processo unidireccional e irreversível. A ideia de que uma única célula é capaz de originar um organismo adulto através de uma sucessiva e organizada sequência de eventos explica a progressão ao longo das diferentes fases do desenvolvimento e também mecanismos de diferenciação que ocorrem já na fase adulta. Exemplo disso é a participação de algumas células estaminais adultas em processos de reparação de tecidos. Em geral, durante o desenvolvimento de um mamífero, dá-se uma progressiva especialização das células embrionárias em outras cada vez mais diferenciadas. Existe assim uma perda sucessiva de plasticidade, ou “potência”, celular ao longo do desenvolvimento das linhagens celulares. Assim, células especializadas numa determinada função não podem regressar a um estado que lhe permita dar origem a células de outras linhagens. No entanto, ao longo dos últimos 20 anos, diversos estudos defendem a possibilidade de que células somáticas adultas podem ser induzidas a regressar a um estado de maior plasticidade através de reprogramação do seu genoma. Durante este processo, uma célula somática é induzida a tornar-se mais indiferenciada ganhando capacidade de se diferenciar em outras células. O primeiro método desenvolvido com o objectivo de reprogramar o genoma de uma célula somática para um estado de maior plasticidade foi a transferência nuclear de células somáticas (SCNT). Os investigadores revelaram que era possível originar células pluripotentes através da transferência de um núcleo de uma célula somática para um oócito. Obteve-se assim a primeira evidência de que o genoma presente numa célula adulta é suficiente para reverter o seu destino a um estado de pluripotência e de que os genes de pluripotência não são irreversivelmente inactivados durante o desenvolvimento. A partir destes estudos, vários grupos de investigação tentaram identificar quais os factores que podem induzir a reprogramação de um núcleo somático a um estado pluripotente. Vários factores de transcrição, como Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc, foram identificados em células estaminais embrionárias, tendo sido demonstrado que eram fundamentais para manter o seu estado de pluripotência. Assim, foi sugerido que após a indução deste genes em células somáticas, onde normalmente não são expressos, estas poderiam adquirir características típicas de células pluripotentes à medida que se reprogramam e se tornam mais indiferenciadas. O desenvolvimento desta técnica abriu novas possibilidades para a aplicação de terapia genética e regenerativa, visto que através deste método se podem originar células de todas as linhagens e se evita a utilização de oócitos ou de células embrionárias. Outro método pelo qual se podem reprogramar células somáticas é através de fusão celular. Diversos grupos demonstraram independentemente que a fusão de uma célula diferenciada com uma célula estaminal embrionária resulta na formação de um híbrido tetraplóide no qual é inibida a expressão de genes específicos da célula somática. Assim, o híbrido contém informação genética de ambas as células, mas comporta-se como uma célula embrionária podendo dar origem a todos os órgãos e tecidos. Estes híbridos sofrem mudanças epigenéticas passando a expressar genes específicos de células pluripotentes, apresentam grande capacidade de auto-renovação e podem diferenciar-se em todos os tecidos originados pelas três camadas germinativas. De maior importância foi a descoberta in vivo de que células originárias da medula óssea podem contribuir para a regeneração de diversos órgãos através de fusão com células danificadas. Apesar de grande parte dos fenómenos de regeneração em mamíferos se deverem à activação de células estaminais adultas, existe a possibilidade de que processos de fusão celular possam contribuir também para a reparação de tecidos. Assim, certas células podem fundir-se com células de tecidos afectados e promover a reparação desse tecido através da formação de híbridos com capacidade de proliferação. Um dos maiores problemas que resulta da formação de híbridos através de fusão é o facto de a célula híbrida ser tetraplóide e potencialmente tumorigénica. Assim, o estudo destes híbridos é importante no sentido de saber se constituem uma opção viável para uma futura aplicação biomédica. Vários estudos, maioritariamente num modelo de regeneração de hepatócitos, mostraram que um híbrido tetraplóide é capaz de proliferar e originar células funcionais após mitose. Contudo, estudos recentes demonstram que apesar de estes híbridos formarem maioritariamente células tetraplóides após divisão, uma percentagem das mitoses origina também células diplóides. Os autores destes estudos apresentam a hipótese de que após a fusão celular, alguns híbridos podem passar por um processo de redução de ploidia e originar células diplóides. Assim, o objectivo deste projecto é caracterizar os híbridos originados por fusão de células somáticas com células estaminais embrionárias no sentido de identificar possíveis evidências de redução de ploidia neste modelo de reprogramação. Para isso, usámos um protocolo de fusão previamente descrito para promover in vitro a fusão espontânea entre células progenitoras neuronais, que apenas podem originar células de linhagem neuronal, com células estaminais embrionárias. As células neuronais usadas contém um promotor Oct4 que controla a expressão de GFP (Proteína Verde Fluorescente) e de uma proteína que confere resistência à puromicina. Assim, apenas resistirão a um meio de cultura suplementado com puromicina se forem reprogramadas para um estado de pluripotência e passarem a expressar o factor de transcrição Oct4. Os clones seleccionados apresentam uma morfologia e capacidade de proliferação semelhante a células estaminais embrionárias. Como esperado, identificámos após selecção clones reprogramados que contêm células tetraplóides. Contudo, células diplóides foram também identificadas nestes clones o que nos levou a pensar que as células híbridas tetrapóides poderiam ter sofrido um fenómeno de redução de ploidia. Para confirmar a origem destas células diplóides, separámos através de citometria de fluxo as células reprogramadas após fusão (células positivas para a expressão de GFP). No momento da análise, todas as células positivas para GFP eram tetraplóides e assim seguimos esta população em cultura ao longo das semanas seguintes. De acordo com a nossa hipótese, uma população de células diplóides foi identificada, o que nos possibilitou confirmar que células diplóides podem originar-se a partir de células tetraplóides após fusão. De seguida, confirmámos também que as células diplóides identificadas não eram resultado de contaminação ou de transdiferenciação, visto que células isoladas foram capazes de proliferar independentemente e originar clones. Identificámos clones constituídos apenas por células diplóides, o que demonstra que as células diplóides provenientes dos híbridos são reprogramadas e expressam o factor de transcrição Oct4. Foram também identificados clones, provenientes de apenas uma célula, que contêm células diplóides e tetraplóides. Esta observação confirma que a redução de ploidia é um fenómeno que pode ocorrer após reprogramação mediada por fusão celular. Contudo, não nos foi possível identificar o processo pelo qual uma célula tetraplóide pode originar células diplóides. Estudos anteriores identificaram mitoses multipolares como possível explicação para o fenómeno. Esta opção parece válida visto que a célula tetraplóide originada por fusão pode conter mais do que dois centrossomas e assim originar mitoses com mais de dois fusos mitóticos, re-distribuindo os cromossomas por mais de duas células-filhas. No entanto, outra hipótese é possível: os híbridos tetraplóides podem entrar em mitose sem passar pela fase S do ciclo celular e assim distribuir igualmente os cromossomas em duas células-filhas diplóides. Outros estudos necessitam de ser desenvolvidos de modo a que este mecanismo seja caracterizado em pormenor. A caracterização de fenómenos de redução de ploidia é importante para entender o papel da reprogramação mediada por fusão celular durante a regeneração de tecidos e para revelar como as células híbridas proliferam para eventualmente repovoar a área danificada.Cosma, Maria PiaRodrigues, Maria Gabriela, 1965-Repositório da Universidade de LisboaFrade, João Manuel Rodrigues, 19882012-05-23T13:49:40Z20112011-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/6362enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:48:51Zoai:repositorio.ul.pt:10451/6362Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:31:31.404524Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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