Significance of mycobacterial peptidoglycan amidation in host immune recognition and antibiotic resistance

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Marques, Mariana Ferreira Balula
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/47729
Resumo: Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020
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spelling Significance of mycobacterial peptidoglycan amidation in host immune recognition and antibiotic resistanceTuberculoseAmidação do peptidoglicanoResistência a antibióticosReconhecimento imune do hospedeiroCRISPRiTeses de mestrado - 2020Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020A tuberculose é uma das 10 principais causas de morte a nível mundial e é causada pela bactéria intracelular Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). De acordo com a Organização Mundial de Saúde, em 2019, aproximadamente 1,5 milhões de pessoas morreram com tuberculose e estima-se que, atualmente, um quarto da população mundial (cerca de 1,9 mil milhões de pessoas) esteja infetada com tuberculose latente. O aparecimento de estirpes multi e extensivamente resistentes é um problema cada vez mais grave e reflete a necessidade urgente de desenvolver novos medicamentos e estratégias que sejam eficazes no tratamento desta doença. Uma característica típica de M. tuberculosis é a sua complexa parede celular, normalmente conhecida como complexo micolil-arabino-galactano-peptidoglicano (mAGP). Tal como o nome indica, o complexo mAGP é principalmente constituído por uma camada de ácidos micólicos de cadeia longa, um polissacárido de arabinogalactano altamente ramificado e uma camada de peptidoglicano (PG). Todos estes componentes contribuem para a resistência natural destas bactérias a muitos antibióticos e para a modulação da resposta imune do hospedeiro. O PG é altamente responsável pela conservação da integridade celular e os seus processos de biossíntese e reciclagem envolvem vários enzimas essenciais para a viabilidade das micobactérias, sendo considerados, portanto, como potenciais alvos terapêuticos. O PG micobacteriano é caracterizado por diversas modificações químicas, tais como a amidação dos resíduos de D-iso-glutamato (D-iGlu) e ácido meso-diaminopimélico (mDAP). Recentemente, foi descoberto que estas reações são catalisadas pelo complexo enzimático MurT/GatD e pelo enzima AsnB, respetivamente. Foi demonstrado que a amidação do D-iGlu tem influência na suscetibilidade a antibióticos, especialmente a antibióticos β lactâmicos, e no cross-linking, enquanto que a amidação do mDAP parece influenciar a modulação da hidrólise do PG. Além disso, a presença destas duas modificações tem sido associada a uma redução da ativação da proteína recetora nucleotide-binding oligomerization domain (NOD) 1 do hospedeiro, indicando um possível papel da amidação do PG no reconhecimento pelo sistema imune do mesmo. Para compreender o papel da amidação do PG em micobactérias tanto na resistência a antibióticos, como no reconhecimento imune do hospedeiro, o sistema clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) de interferência (CRISPRi) foi utilizado para construir mutantes knockdown dos genes murT, gatD e asnB (mutantes murT- , gatD e asnB- , respetivamente) em Mycobacterium smegmatis mc2 155 (M. smegmatis), um dos modelos mais utilizados no estudo da tuberculose. O CRISPRi baseia-se na expressão indutível de uma proteína endonuclease Cas9 enzimaticamente inativa (dCas9), em conjunto com um pequeno RNA guia (sgRNA), que pode ser desenhado para ter como alvo uma sequência de DNA específica. Recentemente, este sistema foi desenvolvido e otimizado para micobactérias, sendo simples, prático e económico na inibição da expressão quer de genes essenciais, quer de genes não essenciais, sem provocar clivagem, nem efeitos off-target. O CRISPRi utiliza como indutor a anidrotetraciclina (ATc) e pode ser modelado por diferentes fatores, nomeadamente a concentração de ATc, o grau de complementaridade entre o sgRNA e a sequência-alvo, e o uso de um motivo de DNA de 2-5 par de bases, situado a jusante da sequência-alvo, designado de proto-spacer adjacent motif (PAM), com “forças” distintas. Para avaliar os efeitos do silenciamento dos genes gatD, murT e asnB na viabilidade e crescimento micobacteriano, foram realizadas experiências de spotting. Através das mesmas, os genes murT e gatD, que pertencem a um operão com um promotor comum, foram confirmados como genes essenciais em M. smegmatis, ao contrário do gene asnB. O nível de knockdown dos dois primeiros genes pareceu estar diretamente relacionado com a força da PAM associada a cada mutante. Nos mutantes associados a PAMs fracas, a distância desde a região alvo ao início do gene também pareceu influenciar o silenciamento mediado pelo CRISPRi. Contudo, através da realização de curvas de crescimento dos controlos e mutantes gatD- , esta última correlação não foi observada, uma vez que o perfil de crescimento dos mutantes associados a PAMs fracas aparentou ser semelhante entre si. Apesar das diversas vantagens do CRISPRi, na ausência de indutor, o perfil de crescimento dos mutantes gatD pareceu indicar a existência de uma expressão leaky da dCas9Sth1, assim como algum nível de toxicidade causado pela sobrexpressão da mesma no controlo de M. smegmatis contendo um plasmídeo CRISPRi vazio não-digerido, na presença de ATc. Os níveis de knockdown de um mutante gatD foram avaliados através de qRT-PCR e obteve-se uma diminuição na expressão do gatD de 8,8 vezes, comparando com a estirpe wild-type na presença de ATc. Este resultado salienta a capacidade do CRISPRi de alcançar uma inibição considerável da expressão de genes específicos em M. smegmatis e, em conjunto com os resultados de caracterização fenotípica, indica que esta inibição é suficiente para causar defeitos no crescimento. Em contraste com resultados anteriormente publicados, não se observou nenhuma evidência da existência de um efeito polar provocado pelo CRISPRi, fenómeno que é bastante frequente quando se silenciam genes pertencentes a operões. Para investigar o papel da amidação do PG na resistência a antibióticos, foram determinadas as concentrações mínimas inibitórias e bactericidas (MICs e MBCs, respetivamente) de três antibióticos β-lactâmicos de três classes diferentes (amoxicilina, cefotaxima e meropenemo), na presença e na ausência de um inibidor de β-lactamases (clavulanato), e de dois antibióticos anti-tuberculose de primeira-linha (isoniazida e etambutol) para todos controlos e mutantes gatD- . Diversos mutantes gatD mostraram uma suscetibilidade aumentada aos antibióticos β-lactâmicos testados, especialmente na presença de clavulanato. Em particular para a cefotaxima, o silenciamento do gatD pareceu contribuir para um maior efeito bactericida. Estes resultados sugerem que a ausência de amidação nos precursores de PG destes mutantes pode fazer com que estes sejam substratos mais pobres para as penicillin binding proteins (PBPs) que catalisam as reações de cross-linking, levando a que estas reações sejam menos eficientes e a que as PBPs sejam mais suscetíveis à ação deste tipo de antibióticos. Assim, a inibição da amidação do resíduo de D-iGlu do PG através do sistema de CRISPRi e a utilização de antibióticos β-lactâmicos poderia funcionar para produzir um efeito antimicrobiano sinérgico mais eficaz. Com o objetivo de compreender a contribuição desta modificação do PG no reconhecimento pelo sistema imune do hospedeiro, foram realizadas infeções de macrófagos de ratinho RAW 264.7 com um mutante gatD e foi investigada a sobrevivência intracelular bacteriana. Os resultados indicaram um decréscimo no número de unidades formadoras de colónias (CFUs)/mL deste mutante, na presença de ATc, às 1, 4 e 24 h pós-infeção, comparando com a estirpe wild-type na presença de ATc e com o mesmo mutante na ausência de ATc. Sabendo que a amidação do resíduo de D-iGlu está ausente neste mutante, esta redução do fitness intracelular poderá ser explicada por um maior reconhecimento das micobactérias pelo macrófagos, resultando numa maior taxa de fagocitose e, consequentemente, numa menor capacidade de sobrevivência intracelular. Estes resultados sustentam a ideia de que esta modificação do PG pode ser uma estratégia das micobactérias para evitar o seu reconhecimento por parte do sistema imune inato do hospedeiro, contudo deverão ser realizadas experiências adicionais. Os resultados apresentados nesta tese mostram o potencial da amidação do PG como possível alvo terapêutico e constituem um bom ponto de partida para uma posterior investigação desta mesma modificação em M. tuberculosis. Paralelamente à construção dos mutantes em M. smegmatis, também diversos mutantes murT- , gatD e asnB foram construídos em M. tuberculosis H37Ra e todos os sgRNA desenhados foram confirmados como idênticos para M. tuberculosis H37Rv, o que facilitará uma aplicação futura destas experiências nestas estirpes, ou ainda, em estirpes clínicas, incluindo estirpes multi e extensivamente resistentes, em condições de biossegurança de nível 3.Tuberculosis (TB) belongs to the top 10 causes of death in the world and it is caused by the intracellular pathogen Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The emergence of multi- and extensive-drug resistant strains of M. tuberculosis remains a serious growing problem and reflects the urgent need to develop new drugs and effective treatment approaches. A typical feature of M. tuberculosis is its complex cell wall structure, well-known as the mycolyl-arabino-galactan peptidoglycan (mAGP) complex and highly responsible for the resistance to many antimicrobial drugs. The mAGP complex includes a distinctive mycobacterial peptidoglycan (PG) layer that undergoes several relevant modifications, of which the amidation of D-iso-glutamate (D-iGlu) and meso-diaminopimelic acid residues are of special interest. Recently, these reactions were found to be catalysed in mycobacteria by the essential MurT/GatD enzymatic complex and by the AsnB enzyme, respectively. Both PG modifications have been shown to influence the bacterial antibiotic resistance, especially to β-lactams, and the host immune recognition. Therefore, to further understand the significance of PG amidation in both contexts, murT, gatD, and asnB knockdown mutants were constructed in the mycobacterial study model, Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis), using the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) interference (CRISPRi) system. CRISPRi is based on the anhydrotetracycline (ATc)-inducible expression of an enzymatically inactive Cas9 protein together with a small single guide RNA (sgRNA) specific to a target gene sequence. It has been proven to be a very simple, useful, and cost-effective platform to repress the expression of either essential or non-essential genes. Using this system, murT and gatD were confirmed to be essential in M. smegmatis, in contrast to asnB, and the level of gatD and murT knockdown seemed to be directly related with the associated proto-spacer adjacent motif (PAM) strength. In murT and gatD- mutants associated with weaker PAMs, the distance of the target gene region from the beginning of the gene appeared to also influence the CRISPRi-mediated gene silencing and, consequently, the growth defects, although this was not confirmed by growth curves. By assessing the levels of knockdown in one gatD mutant, a 8.8-fold decrease in gatD mRNA expression was obtained, compared to the ATc-treated wild-type (WT) strain and, in contrast to previous results, there was no evidence of a polar effect by CRISPRi. Several gatD- mutants showed increased susceptibility to β-lactams (amoxicillin, cefotaxime, and meropenem), particularly in the presence of a β-lactamase inhibitor (clavulanate). This suggested that the lack of amidation displayed by the PG precursors of these mutants could make them poorer substrates for penicillin binding proteins (PBPs) and thus, it could lead to a less efficient cross-linking and to PBPs being more susceptible to the action of these antibiotics. Moreover, it was observed a significant decrease in the bacterial intracellular survival of a gatD knockdown mutant within RAW 264.7 murine macrophages, compared to the ATc-treated WT strain and to the untreated mutant. The absence of a D-iGlu amidation in the mycobacterial PG caused a reduced resistance to β-lactams and appeared to contribute to a higher recognition of mycobacteria by host macrophages.Catalão, Maria João Gracias Fernandes da Costa,1979-Dionísio, Francisco,1971-Repositório da Universidade de LisboaMarques, Mariana Ferreira Balula2023-12-27T01:32:36Z202020202020-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/47729TID:202695336enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-01-01T01:16:20Zoai:repositorio.ul.pt:10451/47729Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:59:44.067274Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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