Exploring the role of the BMP-signaling in the evolution of vertebrate appendages

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Cadete, Francisco Maria Granchinho Bicho Tavares
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/51713
Resumo: Tese de Mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
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spelling Exploring the role of the BMP-signaling in the evolution of vertebrate appendagesPeixe-zebraDesenvolvimentoFinfoldHoxd13aBmp2bTeses de mestrado - 2021Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de Mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasVertebrate appendages have undergone several morphological changes that allowed them to explore new environments. One of these changes was the transition from fish fins to tetrapod limbs. Genes in the 5’ end of the HOXD cluster are known to regulate limb skeletal formation, in particular Hoxd13, which is involved in the formation of the autopod, the most distal structure of the tetrapod limbs. Overexpression of this gene during zebrafish fin development causes endochondral expansion and a concomitant reduction of the finfold, mimicking the major events thought to have happened during fin-to-limb transition. Bmp2 is a downstream target of the Hoxd13 encoded transcription factor, and its overexpression also leads to a similar reduction of the finfold. Here we explored how this hoxd13-bmp2 mechanism mediate finfold size. To this purpose, here we characterized the expression of BMP-signaling related genes in three zebrafish lines with distinct finfold size: 1) wild type; 2) hsp70:hoxd13a transgenics with shorter finfolds; 3) leot1/lofdt2 mutants with longer finfolds. The results suggest that the BMP signaling is enhanced in transgenics with shorter finfolds and inhibited in mutants with longer finfolds, with genes in this network exhibiting distinct heterochronic dynamics. Our data lead to a more profound understanding of the molecular changes involved in the definition of the finfold size, a structure that was progressively eliminated during the fin-to-limb transition in vertebrates.A colonização de ambientes terrestres pelos animais vertebrados foi potenciada por mudanças morfológicas que lhes permitiram sobreviver em novos nichos ecológicos. Uma destas mudanças ocorreu nos seus apêndices locomotores, havendo uma conversão das barbatanas em membros com a origem dos tetrápodes, caracterizados por terem uma nova extremidade distal, o autopódio. Dados fósseis sugerem que a transição entre as barbatanas dos peixes e membros dos tetrápodes envolveu uma expansão sequencial do endosqueleto e uma redução concomitante do dermoesqueleto distal, adaptado para a deslocação em ambiente aquático. Do ponto de vista do desenvolvimento embrionário, os mecanismos iniciais de formação das barbatanas e dos membros são idênticos. Ambos começam com a formação de um botão originado a partir da placa lateral da mesoderme (LPM), seguida pela indução da crista ectodérmica apical (AER). Esta estrutura produz fatores de crescimento de fibroblastos (fgfs) que estimulam o crescimento ao longo do eixo proximal-distal (PD). Simultaneamente, as células do mesênquima posterior formam a zona de atividade de polarização (ZPA), produzindo a proteína Sonic Hedgehog (Shh), uma proteína que se difunde pelo tecido, instigando uma assimetria típica ao longo do eixo ântero-posterior (AP). Deste ponto em diante, o desenvolvimento diverge entre as barbatanas de peixes e os membros de tetrápodes. Durante o desenvolvimento da barbatana, a AER é transitória e é convertida na prega ectodérmica distal (finfold) que corresponde à região onde os típicos raios das barbatanas de peixe se diferenciam. Em contraste, nos tetrápodes, a AER falha em alongar-se e é mantida durante todo o desenvolvimento do membro até à formação do autopódio. Tendo isto em consideração, foi colocada a hipótese de que durante a transição “barbatana-membro”, houve uma mudança heterocrônica na transição de AER para finfold que ocorre mais cedo durante o desenvolvimento em actinopterígios, mais tarde em sarcopterígios e está ausente na linhagem dos tetrápodes. Esta mudança heterecrônica levou à regressão progressiva da finfold em detrimento da manutenção da AER ao longo da evolução. Genes da extremidade 5' do cluster HOXD são conhecidos por regularem a condrogénese nos membros dos tetrápodes, em particular o gene Hoxd13, que está envolvido na formação do autopode, a estrutura mais distal destes apêndices. Durante o desenvolvimento, o Hoxd13 é expresso em duas fases distintas. A primeira fase é conservada durante o desenvolvimento das barbatanas de peixes e dos membros de tetrápodes, sendo a sua expressão restrita à margem posterior do membro em desenvolvimento. A segunda fase de expressão expande-se distalmente ao longo do eixo AP, acabando por ocupar toda a região presuntiva do autopódio, e demonstrando uma separação bem definida da primeira fase, quer temporal quer regional. Durante desenvolvimento da barbatana dos peixes, no entanto, este gene tem uma segunda fase de expressão distalmente mas não se expande completamente ao longo do eixo AP. Considerando os dados anteriores, foi hipotetizado que as mudanças de expressão de hoxd13 terão sido um dos mecanismos por detrás da transição de barabatana para membro de tetrápode. Para testar esta hipótese, Freitas e colegas (2012) imitou esta segunda fase de expressão de membros de tetrápodes durante o desenvolvimento da barbatana e peixe-zebra, gerando transgênicos onde é possível induzir a sobrepressão de hoxd13a logo antes da segunda fase de expressão. A sobrepressão deste gene durante o desenvolvimento da barbatana do peixe-zebra causa expansão endocondral e uma redução concomitante da finfold, simulando os principais eventos que se acredita terem acontecido durante a transição de barbatana para o membro. Num estudo recente do laboratório de acolhimento (Castro et al, 2021), foi investigado o impacto da sobrepressão de hoxd13a em alvos putativos a jusante deste gene durante o desenvolvimento da barbatana de peixe-zebra. Um dos resultados mais notórios consequentes desta sobrexpresssão foi a expressão ectópica de várias proteínas morfogénicas ósseas (BMP) na barbatana com finfolds truncados. Em tetrápodes, já foi observado que bmp2 é um alvo direto do factor de transcrição Hoxd13. De modo a entender melhor o papel do bmp2 na transição de barbatana para membro, estes autores geraram peixes zebra transgênicos, que permitem a sobrepressão de bmp2b antes do início da segunda fase de expressão dos genes 5’HoxD. Estes transgênicos apresentaram um fenótipo semelhante ao encontrado nos peixes transgênicos com sobrepressão de hoxd13a, apresentando uma redução da finfold. Curiosamente, quando Bmp2 é inibido em ratos durante o desenvolvimento dos membros, existe uma elongação da AER, revelando semelhanças com a transição de AER para finfold observada no desenvolvimento de barbatanas. Com isto em mente, a hipótese surgiu de que a modulação da transcrição do hoxd13 pode ter regulado o tamanho das finfolds durante a evolução dos vertebrados induzindo a expressão de bmp2 e incrementando o processo apoptótico nesta estrutura. Assim, é possível que a sinalização intracelular atribuída às proteínas BMP, e que tem revelado ser crucial a tantos processos biológicos, tenha sido a fonte de mudança no desenvolvimento dos apêndices locomotores durante a evolução. Neste projeto, exploramos como o Hoxd13 e seu alvo a jusante, Bmp2, regula o tamanho das finfolds durante o desenvolvimento da barbatana de peixe-zebra. Para este fim os seguintes objetivos foram traçados para este projeto: 1) Caracterizar como a sinalização de BMP varia entre três linhas de peixe-zebra com tamanhos de finfold distintos: a linha tipo selvagem (wtAB), a linha mutante com finfolds longas (leod1/lofdt2) e a linha transgénica com finfolds curtas que sobrexpressa hoxd13a (hoxd13 +++). 2) Comparar a dinâmica de expressão de bmp2 e outros genes envolvidos na sinalização de BMP (smad1, smoc1, smoc2, nogg3, grem1a e msx2b) entre estas distintas linhas de peixe-zebra ao longo de vários estádios de desenvolvimento (desde as 24 até às 120 horas após fertilização). Os resultados da caracterização da sinalização de BMP através de análise de imunofluorescência sugerem que esta é aumentada em transgênicos com finfolds mais curtas e diminuída em mutantes com finfolds mais longas. Olhando para a expressão de bmp2b, os mutantes leod1/lofdt2 demonstram menos expressão deste gene do que na linha wtAB e tendo picos de expressão ligeiramente deslocados para estádios mais tardios em relação à linha tipo selvagem. Em relação aos transgênicos hoxd13 +++, a expressão de bmp2b demonstra um pico de expressão logo após a sobrexpressão de hoxd13a, seguindo por uma diminuição até estádios mais tardios onde a expressão volta a aumentar. Curiosamente, este não foi o único gene encontrado sobrexpresso em resposta à sobrexpressão de hoxd13a. Genes como grem1a, msx2b, smoc1 e smoc2 mostraram também uma regulação positiva após o início da sobrexpressão do gene Hox. Como nenhum destes genes foi identificado anteriormente como alvos diretos a jusante de Hoxd13, a influência deste factor de transcrição sobre estes genes poderá ser indireta, como é o caso do msx2b, um gene apoptótico, que foi identificado como sendo controlado diretamente por sinalização BMP em tetrápodes. Neste estudo, foi observado também que o perfil de expressão do gene msx2b segue um perfil muito semelhante ao observado para bmp2b, em todas as três linhas analisadas. Estes resultados levam a crer que a sinalização de BMP leva à ativação de mecanismos apoptóticos que poderão influenciar o tamanho da finfold através de morte celular programada, à semelhança do que se sucede aquando da perda da membrana interdigital durante a formação dos dígitos dos autopódios em tetrápodes. Tendo estes dados em consideração, propomos que a redução do tamanho da finfold durante a transição de barbatana para membro poderá ter sido mediada pelo aumento da expressão de Hoxd13, promovendo níveis mais altos de sinalização de BMP, que então regulam positivamente a expressão de genes apoptóticos distalmente e levam a uma redução do tamanho das finfolds ao longo da evolução.Freitas, RenataSucena, José Élio da SilvaRepositório da Universidade de LisboaCadete, Francisco Maria Granchinho Bicho Tavares2022-11-27T01:31:21Z202120212021-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/51713TID:202934705enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:56:36Zoai:repositorio.ul.pt:10451/51713Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:02:58.056417Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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