Molecular studies of alpha-synuclein aggregation

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Palmares, Luís Maria Mongiardim
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/48384
Resumo: Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020
id RCAP_6b930588fea20273f3852824381944fe
oai_identifier_str oai:repositorio.ul.pt:10451/48384
network_acronym_str RCAP
network_name_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository_id_str 7160
spelling Molecular studies of alpha-synuclein aggregationAlfa-sinucleínaDoença de ParkinsonMicroscopia de expansão X10InclusõesSTEDTeses de mestrado - 2020Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020A doença de Parkinson (DP) e Demência com Corpos de Lewy são duas das doenças neurodegenerativas mais comuns que afetam o ser humano. Muitos estudos já foram feitos para aumentar o conhecimento existente das doenças, mas continua a haver um longo caminho pela frente até ser possível por um fim às patologias. Estas patologias têm em comum a característica histopatologica da presença de Corpos de Lewy (CL), que são inclusões grandes compostas maioritariamente pela proteína alfa-sinucleína (ASYN) e por diversos outros componentes das células, fazendo parte do seu próprio grupo de doenças denominado “Sinucleinopatias”. O foco principal deste projeto envolve a utilização dos modelos de transfeção de uma proteína de ASYN que possui EGFP truncado no seu C-terminal (SynT), e modelos de transfeção de complementação bimolecular da fluorescência (BiFC) onde são transfetadas duas proteínas (iguais ou diferentes) com cada a possuir uma parte diferente da proteína venus que recupera a sua fluorescência na interação entre proteínas com duas partes diferentes da venus. Estes modelos permitem o estudo da oligomerização de ASYN (BiFC) e de grandes inclusões de ASYN que se assemelham com CL (BiFC e SynT). Um dos maiores objectivos deste projeto é a observação destas inclusões com a utilização de técnicas de microscopia de super-resolução, denominadamente stimulated emission depletion (STED) e microscopia de expansão (ExM) X10. Enquanto que STED já é uma técnica utilizada há mais de 20 anos, X10 ExM é uma técnica relativamente recente, tendo sido primeiro publicada em 2018 e sendo uma adaptação da técnica de microscopia de expansão que foi proposta em 2015. Assim a técnica de X10 ExM ainda é pouco utilizada, não existindo, do meu conhecimento, quaisquer artigos publicados sobre o uso da técnica relativamente a ASYN ou PD em geral. Tendo em conta a novidade que é a técnica de X10 ExM espero conseguir demonstrar através deste projeto o potencial que a técnica tem para não só o estudo de CL como também sendo uma técnica de microscopia de super-resolução que consegue alcançar as resoluções altas de outras técnicas topo-de-linha, ultrapassando a barreira que o limite da difração impõe sobre as resoluções obtidas em microscópios convencionais. Ao mesmo tempo, X10 ExM é bastante acessível em termos dos custos e equipamento necessário, com a técnica possibilitando a obtenção destas altas resoluções em microscópios de fluorescência convencionais, visto que o processo da técnica envolve só a manipulação das amostras em sí, expandindo as amostras até à volta de 10× em todas as dimensões. Através do uso da técnica X10 ExM em modelos de células H4 transfetadas com modelos de SynT e BiFC foi possível observar a ASYN com grande detalhe em comparação às células pre-expansão. Nestas células consegue-se observar o ASYN livre no citoplasma das células com uma distribuição muito mais claramente pontuada, semelhante ao que se observa por microscopia de STED, em comparação ao fundo vermelho difuso que se observa muitas vezes nestas células sem ExM. Também foi possível observar inclusões de ASYN presentes nestas células que aparentam possuir uma estrutura heterogénea, algo que as aproxima da estrutura de CL. De forma a conseguir estudar melhor a heterogeneidade destas inclusões foram feitos estudos de co-localização das inclusões com outras proteínas, das quais já são conhecidas por fazerem parte da composição dos LB, utilizando a técnica de X10 ExM. Infelizmente a utilização desta técnica trouxe uns certos problemas, onde devido ao uso de um passo de digestão que põe as amostras em contacto com Proteanase K, os anticorpos utilizados nessas proteínas acabaram por perder toda ou quase toda a sua fluorescência, impossibilitando o estudo da sua co-localização com ASYN. Devido a este problema o estudo da co-localização ficou limitado às imagens obtidas pre-expansão das células, que pelo menos confirma que todas as proteínas co-localização com estas inclusões (com a exceção de uma das proteínas que no entanto já é confirmado por diversas literaturas como fazendo parte dos CL). Resolver o problema da perda de fluorescência fica assim uma via futura muito importante, podendo ser resolvida por modificações no procedimento como o aumento da concentração de anticorpos utilizados, um passo de “anchoring” das amostras prolongado, adicionar um passo de recuperação dos antigénios, ou até mesmo passar a aplicar a imunocoloração das amostras já depois destas estarem expandidas, embora esta ultíma possível solução pode trazer problemas em relação ao estado desconhecido em que os antigénios se encontram após o procedimento de X10 ExM. A outra técnica de microscopia de super-resolução praticada foi o STED, uma técnica que, ao contrário de muitas outras de microscopia de super-resolução, não precisa de passos de análise da imagem obtida que envolvem a aplicação de modelos matemáticos e software para o melhoramento da resolução. Em vez disso STED funciona pela utilização de um raio STED que é lançado para a amostra numa área com forma de donut a envolver o raio de excitação. O contacto de fluoróforos com o raio STED leva a que a sua fluorescência seja esgota, o que essencialmente leva a que a separação do sinal de diferentes fluóroforos seja facilitada. Ao utilizar esta técnica com células transfetadas com modelos de SynT foi possível obter imagens com qualidade elevada, embora alguma optimização da técnica será necessária para conseguir usufruir do seu potencial completo, e o fotobranqueamento causado pelo uso repetido do raio STED pode trazer algumas dificuldades na análise de inclusões especificas nas células. Mas mesmo assim esta técnica ainda demonstra ser muito vantajosa para o estudo destas inclusões heterogéneas. Uma ferramenta que também foi experimentada com este microscópio foi a escolha do plano em que as imagens são obtidas, algo que permite um estudo mais tri-dimensional da estrutura das inclusões. Possíveis vias futuras que podem ser exploradas seriam a combinação da técnica de X10 ExM com várias outras técnicas de microscopia de super-resolução, como STED que já foi com sucesso combinada com a técnica original de ExM. Com a combinação destas duas técnicas será possível obter resoluções já muito para além dos limites de difração, mas seria necessário o desenvolvimento de fluoróforos para coloração fluorescente baseados em nanocorpos ou moléculas pequenas que sejam compatíveis com a técnica de X10 ExM, devido à distorção na imagem que começa a ser criada pelo tamanho dos anticorpos convencionas utilizados ao chegar-se a resoluções muito elevadas. Após a combinação destas técnicas ficar viável poder-se-ia efetuar Z-stacks destas inclusões de ASYN heterogéneas com immunostaining feito também para outras proteínas que fazem parte da composição dos CL, potenciando desta forma uma análise muito mais detalhada da estrutura destas inclusões por estudos de co-localização. Para estudar estas inclusões num ambiente mais fisiológico ao qual os CL tendem a ser encontrados, estas técnicas poderiam ser aplicadas também a células de cultura primária de neurónios que possuem o fenótipo dopaminérgico, ou até a células imortalizadas que foram diferenciadas para obter esse fenótipo, algo que não está presente em células H4. Este fenótipo é escolhido devido à presença de CL na substantia nigra pars compacta do mesencéfelo em pacientes que possuem a DP. O uso de técnicas de microscopia de super-resolução demonstra ser uma ferramenta extremamente importante para o estudo de sinucleinopatias, com técnicas como X10 ExM, mesmo necessitando de alguma optimização, sendo de extrema importância pela acessibilidade que traz à obtenção de resoluções de 25 nm que são comparáveis a outras técnicas topo-de-linha. A utilização desta técnica sozinha ou junta com outras de microscopia de super-resolução pode ser a chave para um entendimento melhor da composição, estrutura e função dos CL e poderá abrir a porta para o desenvolvimento de novas estratégias que ajudem a lidar com as sinucleinopatias.Parkinson’s Disease (PD) and Dementia with Lewy Bodies (DLB) are two of the most common neurodegenerative diseases that affect humans, which despite the vast amounts of studies that have been done trying to understand these diseases, there is still a lot left to uncover if we ever hope to find a way to combat these pathologies. Given that the alpha-synuclein-containing Lewy Bodies (LB) are a common main histopathological hallmark of these diseases, a better understanding of these abnormal aggregations, namely their composition, architecture and function, could lead us a step further in understanding how to prevent neurodegeneration from occurring due to these pathologies. The main focus of this project relates to how super-resolution microscopy techniques (namely X10 Expansion microscopy (ExM) and Stimulated Emission Depletion (STED)) may be utilized in order to study alpha-synuclein (ASYN) inclusions that can be found in H4 cells transfected with a modified ASYN containing a C-terminal tag in the form of a truncated enhanced green fluorescent protein (SynT) and Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) models, while also performing immunostainings for other proteins that have been found present in the structure of LBs. Of the two super-resolution microscopy techniques a higher focus on the X10 expansion microscopy technique, that allows for the achievement of resolutions around 10 times what you would usually accomplish without requiring a higher-end microscope. With this technique it was possible to observe large inclusions in the aforementioned transfection models that showcase an LB-like heterogenous structure, and also permitted a more detailed look at the free ASYN present in the cells’ cytoplasm. The usage of X10 ExM, however, faces some drawbacks in terms of loss of fluorescent signal that can lead to some immunostained proteins being undetectable from fluorescence microscopy and with the general time that is required for the procedure. Despite these drawbacks X10 ExM still shows promise as a technique that could allow super-resolution microscopy reach a wider usage in comparison to its more expensive super-resolution microscopy counter-parts thanks to it being a relatively cheap and easy to access method. The usage of different display placements and STED microscopy on the other hand, continue to be viable tools for the study of these inclusions, which could even be combined in the future with the X10 ExM technique to allow for the analysis of LBs at an even greater detail than ever before. All in all, super-resolution microscopy techniques, after some degree of optimization, may be the key required for achieving a better understanding of these LBs, something that could very well be essential in learning about their involvement in PD and DLB, and through that possibly helping with the development of novel strategies that could allow us to deal with these pathologies.Outeiro, Tiago Fleming,1976-Gomes, Cláudio M.Repositório da Universidade de LisboaPalmares, Luís Maria Mongiardim2021-06-07T16:44:14Z202020202020-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/48384TID:202695840enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:51:46Zoai:repositorio.ul.pt:10451/48384Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:00:17.563925Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
dc.title.none.fl_str_mv Molecular studies of alpha-synuclein aggregation
title Molecular studies of alpha-synuclein aggregation
spellingShingle Molecular studies of alpha-synuclein aggregation
Palmares, Luís Maria Mongiardim
Alfa-sinucleína
Doença de Parkinson
Microscopia de expansão X10
Inclusões
STED
Teses de mestrado - 2020
Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Químicas
title_short Molecular studies of alpha-synuclein aggregation
title_full Molecular studies of alpha-synuclein aggregation
title_fullStr Molecular studies of alpha-synuclein aggregation
title_full_unstemmed Molecular studies of alpha-synuclein aggregation
title_sort Molecular studies of alpha-synuclein aggregation
author Palmares, Luís Maria Mongiardim
author_facet Palmares, Luís Maria Mongiardim
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Outeiro, Tiago Fleming,1976-
Gomes, Cláudio M.
Repositório da Universidade de Lisboa
dc.contributor.author.fl_str_mv Palmares, Luís Maria Mongiardim
dc.subject.por.fl_str_mv Alfa-sinucleína
Doença de Parkinson
Microscopia de expansão X10
Inclusões
STED
Teses de mestrado - 2020
Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Químicas
topic Alfa-sinucleína
Doença de Parkinson
Microscopia de expansão X10
Inclusões
STED
Teses de mestrado - 2020
Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Químicas
description Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020
publishDate 2020
dc.date.none.fl_str_mv 2020
2020
2020-01-01T00:00:00Z
2021-06-07T16:44:14Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv http://hdl.handle.net/10451/48384
TID:202695840
url http://hdl.handle.net/10451/48384
identifier_str_mv TID:202695840
dc.language.iso.fl_str_mv eng
language eng
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron:RCAAP
instname_str Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron_str RCAAP
institution RCAAP
reponame_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
collection Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository.name.fl_str_mv Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1799134549983100928

Registros relacionados