Evaluation of the therapeutic potential of several compounds in human herpesvirus 8 using a chimera virus mouse infection model

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Rodrigues, Tânia Alexandra da Cruz
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/43189
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019
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spelling Evaluation of the therapeutic potential of several compounds in human herpesvirus 8 using a chimera virus mouse infection modelKSHVLANALatênciaAntiviraisIn vitroTeses de mestrado - 2019Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019O herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV, em inglês), também denominado por herpesvírus humano 8, é um agente infeccioso com a capacidade de estabelecer uma infeção latente vitalícia nas células B do hospedeiro. Este vírus está associado a várias doenças, tais como o sarcoma de Kaposi e a doença de Castleman, e está amplamente disperso pelo mundo. O ciclo de vida é constituído por duas fases: lítica e latente. A fase latente é responsável pela persistência vitalícia do vírus. Embora nesta fase a expressão génica seja bastante limitada, o antigénio nuclear associado à latência (LANA, em inglês) do KSHV (kLANA, em inglês), é expresso abundantemente, sendo uma proteína essencial da fase latente. kLANA é responsável por regular vários processos a nível celular, tais como a transcrição, tanto do vírus como do hospedeiro, a replicação do genoma viral, a reativação lítica, entre outros. Desta forma, kLANA controla a latência do KSHV. Atualmente, o tratamento convencional para as doenças associadas ao KSHV é baseado em agentes anti-tumorais que, apesar de controlarem a evolução da doença, não eliminam a infeção viral. Tendo em conta a epidemiologia e a severidade das doenças associadas ao KSHV, novos fármacos que tenham a capacidade de eliminar a infeção são urgentes. No entanto, a inexistência de um modelo adequado in vivo tem limitado o estudo do KSHV. Face a isto, em 2017 foi desenvolvido um vírus quimérico em que, no genoma do herpesvírus murino 68 (MHV-68), o vírus homólogo de murganho do KSHV, foi substituído o MHV-68 LANA (mLANA) pelo kLANA. Este vírus quimérico permite estudar kLANA como um alvo terapêutico para eliminar a persistência do vírus in vivo. Sulfatiazol e sulfanilamida são dois fármacos que têm sido utilizados como antibióticos. Foi descoberto, in vitro, que podem ser eficazes na eliminação da infeção pelo KSHV, afetando a formação do complexo murino duplo minuto 2 (MDM2)-p53, que inativa a p53 e permite a ligação e estabilização do kLANA ao DNA celular. Glibenclamida é um fármaco atualmente muito utilizado para controlar a diabetes mellitus tipo 2 e que demonstrou ter efeito no KSHV, in vitro, sendo também capaz de eliminar a infeção. Embora ainda sejam necessários estudos para esclarecer o mecanismo de ação da glibenclamida, pensa-se que atua da mesma forma que o sulfatiazol e a sulfanilamida, no complexo MDM2-p53. JQ1 é inibidor de bromodomínios (BRD), uma família de proteínas que está envolvida na transcrição de c-myc. c-myc é um proto-oncogene importante para a formação e manutenção de centros germinais, assim como para o ciclo celular. Para além disso, as proteínas BRD permitem o estabelecimento de latência, associando o genoma viral à cromatina celular. Após a infeção dos murganhos com o vírus quimérico, a eficácia dos fármacos foi avaliada através da determinação da frequência de infeção, quantificação da infeção em centros germinais por expressão da proteína amarela fluorescente (YFP, em inglês) e análise da capacidade de estabelecer latência através de ensaio de reativação ex vivo. Neste estudo, sulfatiazol foi testado em três doses diferentes, 0,25 mg/g de peso corporal, 0,5 mg/g e 1 mg/g. A dose de 0,25 mg/g apresentou uma taxa de sobrevivência de 100%, sem sinais de toxicidade A frequência de infeção, a percentagem de células infetadas nas células GC B pela expressão de YFP e a capacidade de estabelecer latência apresentaram uma diminuição significativa, demonstrando que, nessa dose, o sulfatiazol é eficaz na eliminação da infeção viral. O aumento da dose para 0,5 mg/g apresentou uma diminuição da latência nos três ensaios realizados, em comparação com controlo, e uma taxa de sobrevivência de 100%, também sem sinais de toxicidade. Apenas na frequência de infeção foi observado um decréscimo menor do que com 0,25 mg/g, sendo que nos outros ensaios esta dose demonstrou ser mais eficaz que a dose de 0,25 mg/g. No entanto, com 1 mg/g, a taxa de sobrevivência desceu para 30%, sendo esta dose altamente tóxica. Os resultados obtidos demonstraram uma diminuição significativa da latência viral face ao controlo, apesar da referida redução ser menor do que com 0,5 mg/g, exceto a frequência de infeção. Desta forma, foi concluído que o sulfatiazol é um fármaco eficaz em diminuir a infeção do vírus kLANA.yfp em todas as doses testadas. Na medida em que a dose deve ser obrigatoriamente menor que 1 mg/g, dada a toxicidade associada, e de acordo com os resultados significativos obtidos em 0,25 mg/g e 0,5 mg/g, a dose ideal será igual ou superior a 0,25 mg/g e menor que 1 mg/g. Sulfanilamida foi testada a 0,25 mg/g e a 1 mg/g. A 0,25 mg/g, não se registou nenhum sinal de toxicidade, bem como nenhuma alteração face ao controlo, em todos os ensaios. O aumento para 1 mg/g diminuiu a taxa de sobrevivência para 90%, no entanto os resultados foram significativamente melhores do que com apenas 0,25 mg/g, tendo sido observada uma diminuição significativa face ao controlo, no ensaio de reativação. Por outro lado, a frequência de infeção apresentou uma pequena diminuição e o percentual de células infetadas nas células GC B também teve uma redução, apesar de não ter atingido significância estatística. Assim sendo, pensa-se que a sulfanilamida não tenha efeito na eliminação da infeção viral, sendo apenas capaz de afetar a capacidade de reativação do vírus. Concluiu-se, também, que a dose apropriada para ensaios futuros terá de ser maior que 0,25 mg/g e, dada a toxicidade, obrigatoriamente menor que 1 mg/g. A glibenclamida foi testada a 0,005 mg/g de modo a evitar um efeito letal, dado ser um fármaco hipoglicémico. Embora a taxa de sobrevivência tenha sido 100%, foram observados sinais de toxicidade nesta dose. Para além disso, não foram obtidos resultados significativos nos três ensaios, concluindo que o fármaco não teve efeito na infeção latente. JQ1 foi administrado a 0,05 mg/g e a taxa de sobrevivência obtida foi 100%. Foi observada uma diminuição estatisticamente significativa na capacidade do vírus em estabelecer latência, demonstrada em todos os ensaios realizados. Foi também detetada uma redução no número de esplenócitos totais e de centros germinais. No entanto, ao avaliar a percentagem de células infetadas do centro germinal, observou-se uma diminuição estatisticamente não significativa, e a percentagem de células infetadas com fenótipo de centro germinal permaneceu semelhante. Com base nisso, e sabendo que JQ1 afeta a transcrição de c-myc, essencial para a formação e manutenção de centros germinais, os centros germinais foram isolados e foi determinada a frequência de células positivas para DNA viral em centros germinais. O resultado obtido foi concordante e confirmou o que tinha sido concluído nos primeiros ensaios, não tendo sido observado um decréscimo muito elevado na frequência de infeção em centros germinais. Foi também realizada uma hibridação in situ, de forma a analisar as células infetadas. Foi observada uma diminuição no tamanho das secções do baço de murganho tratados com JQ1, afetando a área, embora o perímetro não tenha sido afetado, uma vez que a diminuição é maior na largura. Apesar de o número de folículos registados ter sido semelhante ao controlo, o tamanho foi significativamente menor (tanto na área como no perímetro), tal como esperado, uma vez que os murganhos tratados com JQ1 apresentam menos centros germinais. Por fim, observou-se uma diminuição estatisticamente significativa nos folículos positivos para RNA viral (com, pelo menos, uma célula infetada), mostrando que a infeção está diminuída devido ao facto de haver menos centros germinais. Desta forma, concluiu-se que o JQ1 aparenta afetar somente o número de centros germinais, o que leva a uma consequente diminuição generalizada da infeção, embora não afete o vírus nem a infeção latente. Neste estudo, duas novas abordagens eficazes contra a infeção viral foram descobertas. Embora o mecanismo de ação dos fármacos seja diferente, tanto o sulfatiazol como o JQ1 revelaram ser promissores para o tratamento de pacientes infetados pelo KSHV.Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), also known as human herpesvirus 8, is an infectious agent able to establish a lifelong infection in B cells of the host. KSHV is associated with several malignancies such as Kaposi’s sarcoma (KS), primary effusion lymphoma (PEL), multicentric Castleman disease (MCD) and KSHV-associated inflammatory cytokine syndrome (KICS). The latent phase of the life cycle is responsible for the long-term persistence of the virus. KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA) is an essential protein in the latent phase, regulating the transcription of both virus and host, genome replication and tumorigenesis and, given this, it is a potential target to clear latent infection. Nowadays, the conventional treatment of KSHV-associated malignancies is based on anti-tumour agents, which control the evolution of the disease but do not eliminate the KSHV infection. Since the discovery of effective drugs is imperative, a chimeric virus in which KSHV LANA (kLANA) was cloned in a murine herpesvirus 68 background, the mouse homologue of KSHV, was used to study kLANA as a target, to assess whether sulfathiazole, sulfanilamide, glybenclamide and JQ1 were able to eliminate persistence of the virus in vivo. Frequency of infection, capacity to establish latency by ex vivo reactivation assay and the infection on germinal centre (GC) B cells assessed by yellow fluorescent protein (YFP) expression were determined and analysed, after infection of mice and treatment with these drugs. Sulfathiazole, a drug that has been used as an antibiotic, showed to be very effective by impairing the formation of the murine double minute 2 (MDM2)-p53 complex, detaching the viral genome from the cellular DNA and diminishing viral infection in vivo using the chimeric mouse model of infection. Sulfanilamide has also been used as an antibiotic and, even though it has the same mechanism of action of sulfathiazole, it did not show a significant effect in clearing the viral infection but reduced the capacity of viral reactivation. Glybenclamide is broadly used in the management of diabetes mellitus type 2. It also reduces KSHV infection in vitro, possibly using a mechanism similar to that of both sulfathiazole and sulfanilamide. At the studied dose, glybenclamide did not display any effect and the viral infection was not affected. JQ1 is an inhibitor of bromodomain proteins, a family of proteins that allows the establishment of latency by the association of the viral genome with cellular chromatin and the transcription of the proto-oncogene c-myc, important to cell cycle progression, as well as to germinal centre formation and maintenance. JQ1 confirmed to be effective in reducing the GC B cells, but not specifically targeting latent virus. Since it decreased the number of GC B cells, including the infected cells, JQ1 was able to significantly reduce the level of systemic infection. In this study, two new effective approaches against the viral infection in vivo, sulfathiazole and JQ1, were discovered. Although the known molecular mechanism of action of the drugs is different, both drugs revealed to be promising for treating patients with KSHV infection.Simas, João Pedro Monteiro e Louro Machado dePereira, José Miguel AzevedoRepositório da Universidade de LisboaRodrigues, Tânia Alexandra da Cruz2020-04-27T15:42:14Z2019-11-292019-10-252019-11-29T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/43189TID:202382095enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:42:56Zoai:repositorio.ul.pt:10451/43189Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:55:45.285096Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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