Microglia demostrate age-dependent performance and interaction with beta-amyloid peptide

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Lidónio, Gonçalo Manuel da Costa, 1988-
Data de Publicação: 2013
Outros Autores: Brites, Dora, 1951-, Dias, Deodália Maria Antunes, 1952-
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/10326
Resumo: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
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spelling Microglia demostrate age-dependent performance and interaction with beta-amyloid peptideDoença de AlzheimerMicrogliaEnvelhecimento celularTeses de mestrado - 2013Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder in the elderly and remains without a cure. One of its prominent features is the appearance in the brain of amyloid-beta (Aβ) deposits forming amyloid plaques. Microglia, which are the first line of defense in the brain, are activated by Aβ assuming a phagocytic phenotype followed by the inflammatory state that is thought to play a role in the progression of this disease. However, the important role of microglia in Aβ clearance and neuronal support seems to be decreased with age, through an ensemble of alterations still not clarified that render cells to function abnormally. Indeed, in these circumstances, microglia lose responsiveness to their key regulating factors, thus compromising their neuroprotective or inflammation solving properties. Therefore, in this work we aimed to: a) understand how ageing influences microglia reactivity to Aβ and microglia-neuron cross-talk dynamics, using an in vitro ageing model of primary microglia (isolated or in mixed microglia-neurons cultures) and by evaluating the release of glutamate, adenosine triphosphate (ATP) and matrix metalloproteinases (MMPs); b) explore the therapeutical properties of a vinyl sulfone-based compound (VS) as a modulator of Aβ-induced microglial activation, using the N9 cell line and assessing cell viability, inflammation-related factors, activation receptors and phagocytosis. Our results demonstrate that microglia behave differently accordingly with age, releasing less glutamate and MMP-9, but more MMP-2. Ageing also seems to render microglia more irresponsive to neuronal-mediated regulation, particularly regarding their ability to modulate the extracellular glutamate content. In addition, in our experimental model of ageing in vitro, Aβ failed to induce any microglia reactivity. In regard to VS testing, no toxicity was observed for this compound, and it successfully diminished the Aβ-induced release of MMP-9 and MMP-2, as well as the expression of high-mobility group box 1 protein, important inflammatory mediators. Moreover, Aβ reduced the level of microglial toll-like receptor 4 and phagocytosis, effects that were counteracted by VS. Overall, these results deepen our knowledge about the role of ageing in microglial biology and elect VS as a potential new therapeutic approach to modulate Aβ-induced microglial activation and dysfunction in AD.A Doença de Alzheimer (DA) é considerada a doença neurodegenerativa mais comum e a principal causa de demência a nível mundial, afectando cerca de 35 milhões de pessoas. Esta doença é caracterizada por uma perda progressiva das capacidades cognitivas, o que leva a um completo estado de debilitação e, por último, à morte. O principal factor de risco é o envelhecimento e permanece sem tratamento até hoje. No encéfalo dos pacientes com DA, para além de uma acentuada perda de neurónios e sinapses, são ainda observadas duas características distintas da doença: emaranhados neurofibrilares e placas amilóides. Os primeiros consistem em agregados filamentosos intracelulares de proteína tau hiperfosforilada, enquanto que as últimas se devem a depósitos extracelulares do péptido β-amilóide (βA), um pequeno fragmento de 38-43 aminoácidos que resulta da cisão sequencial da proteína precursora amilóide por duas secretases, a β-secretase e a γ-secretase. A causa primordial da DA ainda está por desvendar; contudo, o βA, devido aos seus variados efeitos neurotóxicos é apontado como um dos principais factores envolvidos no desenvolvimento da doença. Este, principalmente na forma de 42 aminoácidos, possui uma grande tendência para se auto-agregar, formando estruturas que vão desde oligómeros até fibrilhas, as quais originam as placas amilóides. Apesar de inicialmente se julgarem ser os agregados fibrilares as formas mediadoras de toxicidade, nos últimos anos, as formas oligoméricas têm sido apontadas como as verdadeiramente tóxicas. Porém, além da oligomerização e deposição de βA, outros mecanismos têm vindo a ser estudados pela sua associação com a patofisiologia da DA, nomeadamente a hiperfosforilação da proteína tau, o stress oxidativo, a disfunção mitocondrial e a neuroinflamação. As células da microglia, consideradas as células imunes do sistema nervoso central, desempenham um papel fundamental na resposta inflamatória. Estas células, conhecidas por constantemente sondarem o tecido cerebral e responderem a vários estímulos patológicos no sentido de reporem a homeostasia, são frequentemente encontradas num estado activado e associadas às placas amilóides. Estudos já realizados evidenciaram que o βA interage com a microglia por meio de vários receptores, induzindo a libertação de diversas moléculas de carácter pro-inflamatório e citotóxico. Neste sentido, a deposição de βA pode induzir uma permanente activação da microglia, conduzindo a uma perpetuação da inflamação e, consequentemente, contribuindo para neurodegeneração. Por outro lado, a microglia também é responsável pela libertação de vários factores neurotróficos e pela degradação e fagocitose de βA, funções fundamentais na restrição da acumulação de βA e suporte dos neurónios, impedindo a progressão da DA. Vários estudos têm demonstrado que a microglia durante o envelhecimento e em presença de diversos estímulos assume um fenótipo mais do tipo inflamatório, o qual na presença de uma nova indução acaba por ocasionar uma resposta mais exacerbada. Para tal, pode igualmente contribuir qualquer alteração da comunicação entre a microglia e os neurónios, os quais desempenham um papel fundamental no controlo do estado de activação da célula glial. Provavelmente na sequência destas sucessivas activações a microglia pode tornar-se morfologicamente distrófica, sendo assim frequentemente encontrada no cérebro envelhecido e, principalmente, na DA. Tal indica que estas células sofrem senescência e degeneração com o avanço da idade, predispondo à doença, que por sua vez intensifica a disfunção da célula, possivelmente na sequência da exposição ao βA. Assim, com a idade e/ou à medida que a doença progride, a microglia tende a degenerar, deixando de dar suporte aos neurónios, o que contribui para a sua morte. Este ponto de vista também ajuda a explicar a razão pela qual a abordagem terapêutica com fármacos anti-inflamatórios não esteróides só produz efeitos benéficos nos estádios mais iniciais da doença, enfatizando a importância do intervalo de actuação nas abordagens terapêuticas. Com base no crescente trabalho que tem vindo a ser desenvolvido sobre o papel da microglia na progressão da DA, esta dissertação teve como primeiro objectivo compreender de que modo o envelhecimento microglial influencia a reactividade da microglia ao βA e se a capacidade da microglia responder à sinalização neuronal fica comprometida em resultado do envelhecimento. Para isto, recorreu-se a um modelo de envelhecimento in vitro utilizando células microgliais primárias. Foram escolhidas duas idades celulares diferentes, as de 2 e 15 dias de cultura, de modo a mimetizar um fenótipo microglial jovem e envelhecido, respectivamente. Estas células foram então colocadas na presença, ou não, de neurónios e estimuladas com 50 nM e 1000 nM de βA. Depois da incubação, determinou-se no meio extracelular a concentração de glutamato, de adenosina trifosfato (ATP) e das metaloproteinases de matriz extracelular (MMP), factores que desempenham um papel importante na mediação da resposta inflamatória. Os resultados obtidos demonstraram que a microglia liberta uma menor quantidade de glutamato e de MMP-9 à medida que envelhece. Verificou-se ainda uma ausência de resposta da microglia envelhecida em termos de libertação de glutamato, quando exposta ao βA na presença de neurónios. Em relação à MMP-2, por outro lado, foi demonstrado um aumento na sua libertação pela microglia em resultado do envelhecimento. Quanto à libertação de ATP, em qualquer uma das condições estudadas, não foram observadas alterações. Nesta abordagem, a exposição ao βA também não provocou activação microglial, em qualquer uma das idades avaliadas. Porém, é de salientar que observámos respostas diferentes em termos de libertação de glutamato e MMP-9 e MMP-2 com a idade e, de forma geral, estes resultados fortalecem a ideia de que a biologia microglial se altera como resultado do envelhecimento. Apesar de o envelhecimento poder condicionar a resposta da célula glial ao βA, tal não foi evidenciado pelos parâmetros analisados, pelo que se optará pela determinação de indicadores directos de neuroinflamação no futuro. O segundo objectivo desta dissertação foi o de avaliar a capacidade de uma vinil sulfona (VS) sintetizada pelo grupo de Química Medicinal como modulador da activação microglial pelo βA. Para isto, a linha microglial N9 foi estimulada com as duas concentrações de βA (50 nM e 1000 nM), na presença ou ausência de duas concentrações de VS (10 μM e 20 μM), sendo posteriormente avaliados os seguintes parâmetros: viabilidade celular, libertação de MMPs, capacidade fagocítica da microglia e a expressão de proteínas como milk fat globule-EGF factor 8 protein (MFG-E8), toll-like receptor 4 (TLR-4) e high-mobility group box 1 (HMGB1). A nível de viabilidade, não foram observadas alterações significativas por parte deste composto testado, nem pelas concentrações de βA usadas. Tanto quanto à libertação de MMP-2 e MMP-9 como relativamente à expressão de HMGB1, importantes mediadores da resposta inflamatória, observou-se uma notória indução após exposição ao βA, sendo a mesma revertida após tratamento com VS. Quanto à expressão do TLR-4, verificou-se uma redução na presença de βA, sendo este efeito invertido na presença da maior concentração de VS usada. Em relação tanto à capacidade fagocítica microglial como à expressão de MFG-E8, um factor com um papel importante na fagocitose, foi observada uma redução após indução com βA; porém, apenas a capacidade fagocítica retomou os valores do controlo após adição de VS. Assim, de forma geral, o composto por nós estudado demonstrou ser capaz de reverter alguns dos efeitos causados pelo βA, reduzindo de forma significativa a expressão de factores inflamatórios. Porém, mais estudos ainda têm que ser realizados para determinar a verdadeira extensão dos efeitos mediados por este composto, assim como os mecanismos pelos quais actua. Em suma, estes resultados demonstraram contribuir para o conhecimento de como o envelhecimento da microglia condiciona a funcionalidade da célula e evidenciaram a VS como uma potencial terapêutica a ser explorada na modulação de outros determinantes, quer da activação, quer da latência microglial, observada na DA.Repositório da Universidade de LisboaLidónio, Gonçalo Manuel da Costa, 1988-Brites, Dora, 1951-Dias, Deodália Maria Antunes, 1952-2014-01-28T16:04:17Z20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/10326TID:201336847enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:55:44Zoai:repositorio.ul.pt:10451/10326Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:34:23.258627Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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