An investigation of cell cycle regulation during in vitro models of diapause
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|---|---|
| Data de Publicação: | 2021 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/53666 |
Resumo: | Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2022 |
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An investigation of cell cycle regulation during in vitro models of diapausemESCsdormênciaquiescênciap21cancroTeses de mestrado - 2022Departamento de Biologia VegetalTese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2022Durante o desenvolvimento embrionário, as células do embrião dão origem a diferentes tecidos, dependendo da potência que tiverem. Em estados iniciais do desenvolvimento embrionário, as células pluripotentes surgem no epiblasto (EPI), pré-implantação. Estas células têm a capacidade de formar qualquer tipo de linha celular das três camadas germinativas, e ainda as células germinais primitivas. As células pluripotentes de ratinho podem ser isoladas da massa celular interna do blastocisto (estágio 3.5) e mantidas in vitro, com a capacidade de se dividirem e renovarem-se a si próprias, em um meio condicionado chamado 2i/LIF. Estas células são chamadas de células estaminais embrionárias de rato, com a sigla mESCs (vinda do inglês “mouse embryonic stem cells”). Ainda durante o início do desenvolvimento, os embriões de várias espécies de mamíferos podem entrar num estado de dormência, conhecido como diapausa. Diapausa é caracterizado pelo atraso da implantação do embrião às paredes uterinas. Estudos mostram que este estado é induzível in vitro tanto em blastocistos (pela inibição da hormona estrogénio e injeção diária de progesterona), como em mESCs (pela inibição da molécula mTOR ou da c-Myc). In vivo, após cinco dias da indução da diapausa, foi sugerido que as células da massa celular interna do blastocisto têm um metabolismo semelhante ao dos estados de quiescência. Quiescência é um tipo de paragem do ciclo celular, reversível, que em muitas espécies é semelhante com diapausa. Um exemplo de quiescência foi demonstrado ser provocado após acumulação da proteína p21, em resposta a danificação intrínseca do ADN. Em blastocistos nos quais a diapausa foi induzida, foi sugerido que p21 medeia a retenção das células do blastocisto na fase G0/G1 do ciclo celular e que reduz a replicação do ADN. Apesar disto, ainda não é conhecido se o ciclo celular das mESCs em diapausa é suspenso ou se o seu progresso é desacelerado. Por tanto, ainda não se sabe se este processo é dependente da proteína p21 e/ou se tem outro mecanismo envolvido. O objetivo do meu projeto é caracterizar a regulação do ciclo celular em mESCs, in vitro, e como é iniciado, mantido e terminado o estado de diapausa. Para tal, técnicas de quantificação de imagens de células tanto fixadas como vivas foram usadas para avaliar a expressão de reguladores do ciclo celular. Foi ainda desenvolvido uma linha celular que reporta a atividade de p21 com fluorescência, por CRISPR/Cas9. O avanço do nosso conhecimento nesta área poderá permitir a confirmação de se diapausa ocorre em humanos, em estudos futuros, possivelmente permitindo uma melhor previsão das datas de nascimento. Por outro lado, este avanço poderá ainda informar o nosso conhecimento para descoberta de novas terapias oncológicas, visto que alguns cancros parecem resistir a quimioterapia através da entrada num estado semelhante a diapausa. Aqui, foi reproduzido o modelo de dormência, antes publicado, pela inibição de mTOR (mTORi). Este modelo foi usado para explorar o fenótipo do seu ciclo celular. Através dele, observou se que o mTORi também causa suspensão do progresso do ciclo celular, com a redução da fração de células que estão na fase S do ciclo, aumento das células em G1, e ainda redução dos valores de expressão da proteína ciclina D e da fosforilação da proteína Rb (P-Rb). Resultados semelhantes foram obtidos quando Nutlin foi usada como tratamento, um ativador da proteína p53. Este tratamento também reduziu o crescimento das mESCs, e a fração de células na fase S. No entanto, os valores de fluorescência de P-Rb quando Nutlin é usado sugerem duas populações de células. Quando o ciclo celular destas células tratadas foi analisado, observou-se um aumento da percentagem de células tanto na fase G1 como na G2, sugerindo que a divisão em subpopulações indicadas pelos níveis de P-Rb poderá ser devido a estarem suspensas em fases diferentes do ciclo celular. Adicionalmente, demonstrou-se ainda que mESCs são menos sensíveis a tratamento que inibem CDK4/6, como Palbociclib, em relação a células somáticas. Palbociclib reduziu os níveis de P-Rb e a fração de células da fase S, com o aumento de células em G1. Contrariamente aos outros inibidores usados, com Palbociclib não se observou alterações nas intensidades detetadas da proteína ciclina D. Adicionalmente, com o intuito de acompanhar a dinâmica dos níveis de expressão da proteína p21, em tempo real, enquanto as células entravam e saiam do estado de diapausa, as mESCs foram transfetadas para incorporar o ADN da proteína de fluorescência mRuby, dentro do gene que codifica a proteína p21, usando CRISPR/Cas9. Posto isto, o relatório final do projeto está aqui representado, apontando novos conhecimentos fascinantes e pontos importantes para próximos estudos, na investigação de como as mESCs entram e saem do estado de diapausa.During embryonic development cells can give rise to different tissues, depending on their potency. Early in embryonic development, pluripotent cells emerge in the pre-implantation epiblast (EPI) which have the capacity to form any cell type derived from one of three primary germ cell layers, as well as germ cells. Mouse pluripotent cells can be isolated from the EPI (embryonic day (E)4.5) and maintained in vitro as self-renewing mouse embryonic stem cells (mESCs) in a culture medium called 2i/LIF. Also, early in development, mammalian embryos of various species can go through a dormancy stage, known as diapause, which in mouse is characterized by a delay in blastocyst implantation. This stage has been induced in vitro either in blastocysts or in mESCs by inhibition of oestrogen and daily progesterone injection, or inhibition of c-Myc or mTOR, respectively. In vivo, after five days of diapause induction, it has been suggested that inner cell mass (ICM) cells are metabolically quiescent. Quiescence is a reversible cell cycle arrest that, in many aspects, appears similar to diapause. One example of quiescence is due to accumulation of p21 in response to intrinsic DNA damage. In diapausedblastocysts in vitro, it has been suggested that p21 mediates the retainment of the blastocyst’s cells inG0/G1-phase and DNA replication reduction during diapause. Despite these findings, in diapausedmESCs it is still poorly understood whether the cells are arrested in a particular cell cycle phase or only present a slower proliferation rate. Therefore, it is unclear if this process is p21-dependent and/or if other molecular mechanisms are involved. The aim of my project is to characterize how the cell cycle of mESCs is regulated in vitro and how they enter, maintain and exit diapause. For this, quantitative fixed and live cell imaging was used to evaluate the expression of cell cycle regulators, and I developed a fluorescent reporter of p21 activity, engineered by CRISPR/Cas9. Advancing our knowledge in this area may permit further studies to confirm if diapause occurs in human, by comparing cell cycle regulations between mESCs with hESCs,that may lead to adjusted pregnancy dates. Alternatively, this might provide insight to cancer therapies, since some cancers might resist chemotherapy by entering into a diapause-like state.Here, I reproduce a published model of dormancy using inhibition of mTOR (mTORi). I used this model to explore cell cycle phenotypes and observed that treatment with mTORi also shows cell cycle arrest with a reduction in the fraction of S-phase cells, increase of cells in G1-phase, reduced Cyclin D levels and a reduction of Rb phosphorylation. Similar results were obtained with the p53 activator Nutlin. Nutlin caused reduced growth in mESCs, and a reduction in the fraction of S-phase cells. However, staining for P-Rb following Nutlin treatment suggest two populations of cells. Cell cycle analysis of Nutlin treated cells showed an increase of cells in both G1- and G2- phases. This may suggest that different P-Rb subpopulations are formed depending on which stage of the cell cycle they arrest in. I also show that mESCs are less sensitive to the CDK4/6 inhibitor Palbociclib than somatic cells. Palbociclib also reduces the percentage of mESCs in S-phase, with an increase of cells in G1-phase, reduction of Rb phosphorylation and, in contrast with the other treatments, I observed no change in Cyclin D intensity. In addition, in order to track p21 expression dynamics in real-time as cells enter and exit diapause states, I transfected mESCs to incorporate mRuby DNA (red fluorescence protein) within the p21 coding gene, by CRISPR/Cas9. Taken together this improves our understanding of cellular quiescence and points towards next steps in the investigation of how mESCs enter and exit a diapause-like state.Leitch, HarryRodrigues, Maria Gabriela, 1965-Repositório da Universidade de LisboaAlmeida, Andreia2022-07-06T10:04:19Z202220212022-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/53666enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:59:41Zoai:repositorio.ul.pt:10451/53666Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:04:37.238085Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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