Purification of antimicrobial peptides secreted by Saccharomyces cerevisiae and proteomic analysis of cell membrane-associated proteins

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Santos, Lara Andreia Brito dos
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.26/11109
Resumo: Dissertação para obtenção do grau de mestre na Escola Superior de Saúde Egas Moniz
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spelling Purification of antimicrobial peptides secreted by Saccharomyces cerevisiae and proteomic analysis of cell membrane-associated proteinsAntimicrobial peptidesPreparative chromatographyProteome of cell membraneCell deathPéptidos antimicrobianosCromatografia preparativaProteoma da membrana celularMorte celularDissertação para obtenção do grau de mestre na Escola Superior de Saúde Egas MonizSaccharomyces cerevisiae secretes antimicrobial peptides (AMPs) during mixed culture fermentations that are derived from the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) enzyme and induce the early death of non-Saccharomyces yeasts. Considering the potential of AMPs to be used as natural preservatives in wine, the first aim of the present work was to produce and purify them in a preparative scale so that they could be applied in winery fermentations. Firstly, we produced 3 L of S. cerevisiae fermentation supernatants and subjected those to ion-exchange chromatography using a preparative DEAE-Sephadex column. One bioactive fraction, exhibiting a chromatographic profile similar to that exhibited by the previously found AMPs, was obtained. However, our work showed that the chromatographic system used was not fully efficient to purify the AMPs in a single step, requiring an additional size-exclusion chromatographic step. Several studies have shown that early death of non-Saccharomyces yeasts during wine fermentations is induced by S. cerevisiae through cell-cell contact and secretion of AMPs. Moreover, unpublished work showed that S. cerevisiae cells pre-grown for 48 h are able to induce death of Hanseniaspora guilliermondii by cell-cell contact, while 12 h-grown cells are not. Considering these findings and knowing that GAPDH is a cell wall-associated protein in S. cerevisiae, we hypothesized that these AMPs could be present in the membranes of S. cerevisiae and in this way induce death of non-Saccharomyces by cell-cell contact. The second aim of our work was to analyze membrane proteins of S. cerevisiae cells grown for 12 h and 48 h, using two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Proteomic analysis revealed the presence of two spots of molecular weight and isoelectric point similar to the previously found AMPs, which were differentially expressed in the two growth stages. The spots were analysed by mass spectrometry, confirming the presence of GAPDH-derived peptides. Thus, our work raised evidence that death of non-Saccharomyces yeasts by cell-cell contact might be due to the presence of GAPDH-derived AMPs in the membranes of S. cerevisiae cells. However, to definitively confirm this hypothesis further work is required.Durante fermentações vínicas efectuadas com culturas mistas, a levedura Saccharomyces cerevisiae liberta péptidos antimicrobianos, que derivam da enzima gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e provocam a morte prematura de leveduras não-Saccharomyces. Considerando o potencial destes péptidos antimicrobianos para serem usados como conservantes naturais do vinho, o primeiro objectivo deste trabalho consistiu na sua produção e purificação a uma escala preparativa, de forma a poderem ser aplicados em fermentações de adega. Primeiramente, produziram-se 3 L de sobrenadantes de fermentações efectuadas com S. cerevisiae que, em seguida, foram sujeitos a uma cromatografia de troca iónica utilizando um coluna preparativa DEAE-Sephadex. Foi obtida uma fracção bioactiva que exibia um perfil cromatográfico semelhante ao exibido pelos péptidos antimicrobianos previamente identificados. Embora tenha sido possível purificar os referidos péptidos com a coluna cromatográfica preparativa, os resultados deste trabalho mostraram que o sistema cromatográfico utilizado não foi suficientemente eficiente para isolar os péptidos de interesse num único passo. Assim propõe-se que de futuro se utilize um passo adicional de cromatografia de exclusão molecular que permita isolar a fração péptica (proteínas <10 kDa) antes da utilização da coluna de troca iónica. Vários estudos têm demonstrado que a morte prematura de leveduras não-Saccharomyces durante fermentações vínicas é induzida por S. cerevisiae através de diferentes mecanismos: contacto célula-a-célula e secreção de péptidos bioactivos. Adicionalmente, um trabalho ainda não publicado mostrou que células de S. cerevisiae crescidas durante 48 h são capazes de induzir a morte de Hanseniaspora guilliermondii por contacto célula-a-célula, enquanto células crescidas durante 12 h não apresentaram o mesmo efeito. Tendo em consideração estes dados e sabendo que a GAPDH é uma proteína da parede celular da S. cerevisiae, formulou-se a hipótese destes péptidos bioactivos estarem presentes na parede celular de células crescidas durante 48 h e desta forma induzirem a morte de não-Saccharomyces por contacto célula-a-célula. Assim, o segundo objectivo deste trabalho consistiu na análise das proteínas de membrana de células de S. cerevisiae crescida durante 12 h e 48 h, respetivamente. A análise das proteínas de membrana por eletroforese bidimensional em géis de poliacrilamida revelou em ambos os proteomas a presença de dois spots, exibindo pesos moleculares e pontos isoeléctricos muito semelhantes ao dos péptidos bioactivos previamente identificados. Para além disso, no proteoma das células crescidas durante 48 h os referidos spots mostraram estar sobre-expressos. Os referidos spots foram analisados por espectrometria de massa, o que confirmou a presença de péptidos derivados do GAPDH. Assim, este trabalho forneceu evidência experimental de que a morte de leveduras não-Saccharomyces por contacto célula-a-célula com S. cerevisiae pode resultar da presença dos péptidos antimicrobianos derivados do GAPDH. Porém, para confirmar definitivamente esta hipótese serão necessários ainda estudos futuros.Almeida, Maria Gabriela Machado deAlbergaria, Maria Helena Whytton da Terra Soares deRepositório ComumSantos, Lara Andreia Brito dos2016-01-28T16:12:59Z2015-09-01T00:00:00Z2015-09-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.26/11109201003759enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2022-10-06T14:51:49Zoai:comum.rcaap.pt:10400.26/11109Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T15:06:48.650278Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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