Unveiling the APP role in cell migration

• Autor(a) principal: Pinho, Ana Catarina Dinis de
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10773/11629
• topic: Biomedicina; Citologia; Doença de Alzheimer; Proteínas

A proteína precursora de amilóide de Alzheimer (PPA) é uma glicoproteína transmembranar com propriedades de adesão, descrita como reguladora positiva de migração celular. Embora ubíqua, a isoforma 695 da PPA está enriquecida no cérebro e pode funcionar na migração neuronal de novos neurónios que emergem de nichos neurogénicos existentes no cérebro adulto. No presente trabalho, objetivámos desvendar o papel da PPA e do seu fragmento secretado (sPPA) na migração celular, particularmente na migração de células do tipo neuronal, e os mecanismos moleculares subjacentes. Realizaram-se estudos de biologia celular em células SH-SY5Y humanas do tipo neuronal transfectadas com o cDNA de fusão PPA-GFP ou o vector EGFP, e sujeitas ao ensaio de ‘Scratch Wound Healing’ na presença ou ausência de sPPA. A eficiência de migração das células SH-SY5Y foi monitorizada a cada hora através de imagens de microscopia. O número de células migratórias recrutadas, e a distância e velocidade de migração da margem foram os parâmetros monitorizados nas células não transfectadas, para analisar o papel parácrino do sPPA. A coordenação, distância e velocidade de migração celular, e a distância migrada “fora-da-trajectória”, foram determinadas por análise da trajectória de cada célula transfectada, para estudar o papel autócrino da PPA transmembranar. A influência da PPA no fenótipo migratório e na distribuição da F-actina foram analisadas em células SH-SY5Y fixadas, e em condições ‘in vivo’ em células HeLa fluorescentes coexpressando PPA-GFP e um marcador fluorescente de F-actina (LifeAct-RFP). Estas células migratórias foram ainda sujeitas a análise por FRAP para estudar os efeitos da PPA na dinâmica do citoesqueleto de F-actina. Foi também avaliado o efeito da PPA na activação da Cdc42, um membro da família das Rho GTPases que regula a polarização celular e a formação de filopodia, influenciando assim o direcionamento da migração. Os nossos resultados mostram que o sPPA aumenta o número de células migratórias em períodos mais tardios, diminui a velocidade migratória da margem e aumenta a distância migrada “fora-da-trajectória”. A PPA transmembranar foi observada como tendo um papel na coordenação e persistência direcional da migração celular, numa forma dependente da desfosforilação do seu resíduo S655. Adicionalmente, análises morfológicas mostraram que a PPA ajuda as células a adquirir a distribuição de F-actina assimétrica polarizada característica de células migratórias. Os dados de FRAP sugerem que a PPA aumenta a estabilidade da F-actina quer na frente quer na traseira das células migratórias, aumentando a eficiência da migração celular uma vez que a adesão célula-substrato pode orientar a direccionalidade da migração. Finalmente, observámos que a PPA liga à Cdc42 e aumenta a sua ativação, outro mecanismo pelo qual a PPA pode determinar a migração direcionada. Estes resultados ajudam a desvendar os mecanismos moleculares subjacentes ao papel da PPA na migração celular, com potenciais aplicações no estudo da migração neuronal na neurogénese adulta.