As proteínas HBP/SOUL : sobre-expressão, purificação e estudo de mutantes

• Autor(a) principal: Aveiro, Susana Seabra
• Data de Publicação: 2009
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10773/4869
• topic: Métodos biomoleculares; Proteínas; Separação química; Mutagénese

O objectivo deste trabalho consistiu na optimização da purificação das proteínas HBP/SOUL que ligam ao grupo Hemo, bem como o estudo da interacção destas proteínas, e seus variantes, com grupos tetrapirrólicos. Na optimização do processo de purificação, a lise celular foi uma das etapas estudadas, comparando-se a eficácia da lise celular através do uso de sonicação e alta pressão. Esta avaliação foi feita por comparação dos géis SDS-PAGE obtidos a partir dos extractos celulares. Para além da lise celular, foi também estudada a purificação por cromatografia de afinidade, com o recurso de resinas Ni-NTA, com o intuito de encontrar o melhor gradiente de imizadole para obter uma fracção de HBP/SOUL o mais pura possível. A proteína mHBP foi posteriormente sujeita a estudos de extinção de fluorescência, quando exposta a compostos tetrapirrólicos nomeadamente a Hemina e a Protoporfirina IX. Estes estudos foram alargados a determinados mutantes da mHBP, nomeadamente a M59S, M63S, R181A, uma vez estes resíduos se situarem na região de ligação da mHBP aos compostos tetrapirrólicos. As constantes de dissociação determinadas indicam que a alteração da polaridade na região hidrofóbica de interacção da mHBP com o grupo Hemo, não tem efeitos significativos na afinidade da interacção destas duas moléculas. Através da mutagénese dirigida foi possível a construção de mutantes de HBP nomeadamente R56A, R56E, K56A/K64A possibilitando assim no futuro, a continuação dos estudos de extinção de fluorescência de forma a compreender a função destas proteínas em relação ao grupo Hemo.