Estudo dos antiporters Na+/H+ NhaC e NhaE de Neisseria meningitidis

• Autor(a) principal: VIDEIRA, Marco André Moras
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/19208
• topic: Parasitologia médica; Biologia molecular; Medicina tropical; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas

Os antiporters Na+/H+ são proteínas membranares, encontradas em todos os reinos e envolvidas na homeostasia do Na+ e do pH. Dois antiporters Na+/H+, denominados NmNhaC e NmNhaE foram identificados no genoma da bactéria patogénica, Neisseria meningitidis, e estudados através da sua expressão heteróloga numa estirpe de E. coli deficiente em antiporters Na+/H+, a estirpe E. coli KNabc. Os antiporters Na+/H+ de N. meningitidis, foram capazes de conferir resistência ao Na+, a esta estirpe, sugerindo que os dois possam contribuir para a homeostasia do Na+ e pH. O NmNhaE é também capaz de transportar Li+, e parece ser o principal antiporter Na+/H+ a contribuir para este papel em N. meningitidis. O NmNhaE tem atividade de antiporter Na+/H+ entre valores de pH 6.5 a 9, e a atividade Na+(Li+)/H+ ótima é observada a pH 7. Além disso, verificou-se que o NmNhaE tem maior afinidade para o Na+. Com o objetivo de encontrar resíduos importantes na função e estrutura do NmNhaE, dez resíduos de aminoácidos foram selecionados apartir de comparações de alinhamentos entre sequências de aminoácidos, e também através de estudos anteriores de mutagénese dirigida noutros antiporters Na+/H+, tendo as mutações pontuais sido intruzidas no gene nhaE, resultando nas mutações E91Q, H161L, G174S, D182N, H201L, V258T, H272L, H356L, H361L e G413S. Quando a expressão dos mutantes foi induzida em E. coli KNabc, todos os mutantes, com exceção dos mutantes G174S e H201L, foram capazes de complementar a estirpe KNabc, permitindo que esta crescesse em meio LBK líquido com NaCl 500 mM. Este facto sugere que as mutações G174S e H201L podem impedir a atividade de antiporter Na+/H+. Nos mutantes E91Q, V258T e H361L o Km determinado a pH 7, para o Na+, é semelhante ao determinado no NhaE selvagem, contudo o seu Vmax sofreu uma descida de quase duas vezes. Além disso, a atividade medida a pH 7 para os mutantes V258T e E91Q, e a atividade medida a 7.5 para o mutante V258T, diminuiu relativamente ao NhaE selvagem. Este resultado juntamente com as atividades medidas a pH 7 e 7.5, sugerem que os resíduos E91, V258, H361 estejam envolvidos na resposta ao pH. No mutante H272L, verificou-se um aumento no Km determinado para o Na+ a pH 7 para quase o dobro, enquanto o Vmax se manteve inalterado em relação ao NhaE selvagem. Os parâmetros cinéticos e as atividades medidas a pH 7 e 7.5 sugerem que o resíduo H272 pode estar envolvido no transporte de Na+ e também na resposta ao pH. Nos restantes residuos não se verificou atividade de antiporter Na+/H+. Este trabalho contribuiu para uma melhor compreensão do transporte de Na+ nos antiporters Nha de N. menigitidis, nomeadamente no funcionamento e estrutura do NhaE. No futuro, este trabalho pode fornecer informação relevante quanto ao papel do Na+ na infeção e sobrevivência desta bactéria no hospedeiro.