Non-invasive molecular genetics studies of Iberian wolves in Alvão/Padrela

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Quaresma, Andreia de Oliveira
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/25759
Resumo: Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016
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spelling Non-invasive molecular genetics studies of Iberian wolves in Alvão/PadrelaLobo IbéricoBiologia da conservaçãoMonitorização populacionalAmostras não-invasivasMarcadores molecularesTeses de mestrado - 2016Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016Inicialmente, o lobo (Canis lupus, Linnaeus 1758) tinha uma área de distribuição por todo o Hemisfério Norte, adaptando-se a diversos tipos de habitat. Depois do Homem são o segundo mamífero com maior área de distribuição. Devido à sua facilidade de adaptação e a uma dieta variada, o lobo substitui facilmente as presas selvagens pelas domésticas, entrando em conflito com o Homem. Até meados do seculo XIII, o lobo era muito comum por toda a Europa. O seu extermínio começou a partir do seculo XIX na Europa Ocidental e a partir de 1950 na Europa de Leste, consequentemente com a destruição de habitats e o declínio das suas presas naturais, a sua área de distribuição foi reduzida a 80% na Eurásia, 98% no México e Estados Unidos e 20% no Canada e Alasca. Atualmente, na Europa estão descritas 9 populações de lobo cinzento, uma delas encontra-se na Península Ibérica, o Lobo Ibérico (Canis lupus signatus, Cabrera 1907) e distribui-se pelo noroeste da Península Ibérica, havendo uma pequena população isolada no sul de Espanha, Serra Morena. Estima-se que existam cerca de 2 500 indivíduos e, encontra-se classificada como “Quase Ameaçada”. Em Portugal, segundo o último censo, existem cerca de 300 lobos separados pelo rio Douro em dois grupos populacionais. A população a norte deste rio encontra-se dividida em três núcleos populacionais: o núcleo de Penada-Gerês (Noroeste de Portugal), o núcleo do Alvão (Centro-norte de Portugal) e o núcleo de Bragança (Nordeste de Portugal). A população a sul do rio está dividida nos núcleos de Arada/Trancoso e Sabugal e evidencia um elevado nível de fragmentação e isolamento. Na Europa, vários países subscreveram a Convenção de Berna (82/72 de 19 de Setembro de 1979), onde consta que tanto a espécie de lobo como o seu habitat são estritamente protegidos. Na Diretiva Habitats (92/43 de 21 de Maio de 1992), o lobo europeu é considerado uma espécie com necessidade de conservação do seu habitat (apêndice II) e encontra-se estritamente protegido (apêndice IV). Em Portugal, a espécie está considerada como “Em Perigo” e está protegida pela Lei nº 90/80, de 13 de Agosto e pelo Decreto-Lei nº 139/90, de 27 de Abril, que proíbem a sua captura e abate, a destruição do seu habitat e a sua perturbação. O Instituto de Conservação da Natureza e da Floresta (ICNF) é a instituição governamental responsável pela conservação e gestão do lobo em Portugal. Esta instituição implementou um sistema de compensação de prejuízos por ataques perpetrados por lobos e medidas de suporte à prevenção destes ataques. Um Sistema de Monitorização de Lobos Mortos foi também implementado, em 1999, com o objetivo de recolher todos os lobos mortos encontrados no país. A conservação de espécies ocupa um lugar de destaque na genética da conservação, compreendendo diversas áreas científicas. Através da aplicação de marcadores moleculares, como os microssatélites e SNPs, é possível estudar a variabilidade genética de uma espécie e, consequentemente estudar parâmetros genéticos importantes como: níveis de endogamia, fluxo genético ou o tamanho efetivo de uma população. Neste projeto foi utilizado um painel de 17 microssatélites com o objetivo de estudar a população lupina na região de Alvão/Padrela. Foram recolhidos 93 dejetos, entre 2014 e 2015. Das 93 amostras retiradas dos dejetos, 54 foram amplificadas com sucesso e genotipadas. Destas 54 amostras, 13 foram identificadas como lobos, através de análise Baiseana, sendo que 2 destes genótipos representam uma possível recaptura, dando um total final de 12 lobos encontrados nesta amostragem. Os parâmetros genéticos das 54 amostras foram estimados conjuntamente com as bases de dados de cães e lobos ibéricos. Foi também determinado a presença de possíveis híbridos, através do estudo do locus K, e a identificação do sexo das amostras. Das 54 amostras genotipadas, 8 foram amplificadas com sucesso para o estudo do ADN mitocondrial (linhagem materna). Antes de se proceder à extração do ADN dos dejetos, estes foram sujeitos a uma análise visual da qualidade do material genético que se encontra sob a forma de uma camada transparente de células na superfície da amostra recolhida. A qualidade desta camada está relacionada com a taxa de sucesso do PCR, tal como foi determinado. De uma amostragem de 26 dejetos registados como bons, a taxa de sucesso do PCR foi de 88%. Por outro lado, de 11 amostras assinaladas como más a taxa de sucesso do PCR foi de 9%. O erro de genotipagem estimado para as 54 amostras foi 33% por loci de allelic dropout. A heterozigotia observada foi inferior à esperada (0,49 versus 0,63), o que poderá ser explicado pela existência de uma população não-panmítica, bem como, pela presença de falsos homozigotos devido aos erros de genotipagem que poderão influenciar os resultados estimados, levando a que uma menor heterozigotia seja calculada. O Índice de Fixação tem um valor mais alto que o calculado para a população de referência do lobo usada e pode dever-se à ocorrência de endogamia, alelos nulos ou ao Efeito de Wahlund que se traduz numa redução da heterozigotia numa subpopulação devido ao baixo número de indivíduos que formam essa população. Possíveis relações de parentesco que existam devido às amostras serem recolhidas numa área pequena e, consequentemente haver uma grande probabilidade de pertencerem à mesma alcateia pode, também, explicar este valor. Um baixo número de reprodutores pode levar à fixação de alelos e, consequentemente, a um bottleneck da população. Estes alelos podem ser determinados pela presença de alelos privados estimados. Nas amostras de lobo foram identificados 4 alelos privados com uma frequência superior a 0,020. Foram calculadas as Probabilidade de Identidade entre indivíduos (PI), isto é, a probabilidade de dois indivíduos ao acaso partilharem o mesmo genótipo, e a Probabilidade de Identidade entre irmãos (PIsib), ou seja, a probabilidade de similaridade genética entre irmãos, obtendo-se um valor de 7,4x10-14 e 3,4x10-6, respetivamente. Estes valores indicam uma baixa probabilidade de duas amostras retiradas ao acaso da população em estudo terem o mesmo genótipo. Considerando as relações de parentesco foi possível estimar 2 relações ascendência/descendência e 1 possível caso de irmãos. Uma árvore filogenética foi construída com base nas 8 amostras amplificadas e sequenciadas e, é possível observar uma divisão entre os ramos de cães e lobos. As sequências mitocondriais dos lobos foram sujeitas a BLAST e uma similaridade com um haplótipo descoberto em Portugal foi encontrada (Genbank: KT448278). Um dos atuais focos de preocupação da conservação do lobo na Europa é o aumento de casos de hibridação entre cães e lobos, principalmente em locais de baixa densidade lupina. Esta hibridação pode ter consequências importantes para a conservação dos lobos devido à intensiva seleção artificial a que os seus congéneres domésticos foram sujeitos para interesse do Homem. A propagação de genes domésticos para o lobo pode perturbar as adaptações locais ou aumentar a homogeneização genética tornando-se num dos principais problemas para a conservação da espécie selvagem. Até ao momento, em Portugal, apenas um hibrido foi encontrado na zona do Minho. Uma técnica utilizada na deteção de híbridos passa pelo estudo do gene CBD103 (locus K). Este gene sofreu uma deleção de 3 pb no cão, estando ligado à característica do pelo preto em, pelo menos, 50 raças de cães. As 12 amostras de lobo foram testadas para o locus K com o objetivo de determinar possíveis sinais de hibridação. Nenhum hibrido foi encontrado na zona de estudo. Este trabalho mostra que o conhecimento da diversidade genética das populações pode ser obtido através do uso de marcadores moleculares em amostras não-invasivas. Esse conhecimento é necessário na conservação, a longo-prazo, das espécies.Awareness of the worldwide extinction and decline of wolf populations has led to the development and implementation of legal protection and conservation measures. Use of molecular markers in non-invasive samples can be used for population monitoring with a view towards conservation. Genotyping microsatellites serves to determine the number of offspring born per year, the genetic flux between subpopulation and damage caused by humans to habitats by fragmentation that can lead to population isolation. In this study 93 scat samples were collected between 2014 and 2015 and analysed. Out of the samples, 54 were successfully genotyped and 13 assigned as wolves by Bayesian analysis. As 2 out of the 13 samples were recaptures, the total number of assigned wolves was 12. Genetic parameters, sex and the presence of hybrid signal (K locus) in the genotyped samples was determined. From the 54 genotyped samples, 8 were amplified for mtDNA. The genotyped samples assigned as wolves had 33% allelic dropout and a Probability of Identity of 7.4x10-14. The observed heterozygosity was lower than expected (0.49 against 0.63) which could be explained by the existence of a non-panmictic population and allelic dropout. The inbreeding values are high which could derive from high inbreeding, null alleles or possibly the Wahlund Effect. Low number of reproductive individuals can lead to an allele fixation that can be determined by the presence of private alleles. For these samples, the number of private alleles was 4. Sex identification for each wolf sample gave 3 males and 7 females. Kinship showed 2 possible parent/offspring relationships and one case of full siblings. The wolves from Alvão showed a homozygous genotype for a non-mutated allele in the K locus, which means no hybrids presence. For the study of the mtDNA, from the 8 samples amplified, 3 were from wolves, 4 from dogs and 1 from a fox. The phylogenetic tree produced separated these samples in different branches according to each species. The wolf mtDNA analysis blasted against a Portuguese partial mitochondrial genome (KT448278). This work shows that information relating to genetic diversity can be obtained using molecular markers in non-invasive samples, and such knowledge is necessary for long-term species conservation.Fonseca, Francisco Petrucci,1953-Simões, FernandaRepositório da Universidade de LisboaQuaresma, Andreia de Oliveira2017-01-05T15:13:17Z201620162016-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/25759TID:201623587enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:15:28Zoai:repositorio.ul.pt:10451/25759Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:42:34.632902Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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