A cold-adapted subtilisin-like serine protease: production, purification and application

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Gonçalves, Ricardo Daniel Gavina
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1822/80448
Resumo: Dissertação de mestrado em Genética Molecular
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spelling A cold-adapted subtilisin-like serine protease: production, purification and applicationUma subtilase serina protease adaptada ao frio: produção, purificação e aplicaçãoOtimisação de produçãoProjeto composto centralSubstrato insolúvelVPRpProduction optimisationCentral Composite DesignInsoluble substrateCiências Naturais::Ciências BiológicasDissertação de mestrado em Genética MolecularVPRp é uma subtilase serina protease isolada da bactéria gram-negativa psicrofílica Vibrio sp. PA-44. Devido a partilhar homologia com proteinase K, possui o potencial para uma ampla especificidade de substratos. Tais características sugerem um elevado potencial para uso em várias aplicações, entre as quais a decomposição eficiente de biomassa rica em proteínas. Atualmente, esta protease é produzida em E. coli por produção batch e o presente estudo objetivou otimizar o processo de produção batch e avaliar o papel das principais variáveis do processo na produtividade de VPRp. Além disso, a proteína foi purificada e investigada para uso na quebra de um substrato de proteína insolúvel. Estudos preliminares de vários meios e seus componentes sugeriam 2xYT como o meio de escolha devido à compatibilidade com cálcio, conforme necessário para a estabilidade de VPRp e altos níveis de produção. Para otimização do processo de produção, uma técnica estatística multivariada, nomeadamente, metodologia de superfície de resposta (MSR) com um projeto composto central (PCC), foi aplicada para desenho experimental, modelagem estatística, avaliação do modelo aplicado, avaliação de variáveis de processo e identificação das condições do processo para produção máxima de VPRp. Os efeitos das variáveis de processo: concentração de IPTG, tempo de indução e período de indução foram estudados e um modelo quadrático com um valor de p <0,01 foi aplicado para descrever o conjunto de dados e prever a variável de resposta. O tempo de indução e o período de indução mostraram-se críticos para a produção de VPRp. Utilizando o modelo quadrático, as condições ótimas das variáveis do processo foram identificadas como indução com 1,35 mM de IPTG a 15,2 h de incubação durante um período de indução de 34,4 h. Um protocolo de purificação de três etapas foi desenvolvido para purificar VPRp produzido intracelularmente e possibilitou a obtenção de 217 mg de protease pura por litro de cultura de produção. Uma investigação comparativa da atividade de VPRp na solubilização de substrato de proteína insolúvel indicou maior atividade com esta enzima em comparação com três proteases comerciais. Foi 1,7 vezes mais ativa que a sua homóloga mesofílica proteinase K sob as condições de temperatura moderada (25 °C) utilizadas, enquanto as outras proteases demonstraram apenas atividade residual ou nenhuma atividade. Tais observações são promissoras para estudos futuros.VPRp is a subtilisin-like serine protease isolated from the psychrophilic gram-negative bacterium Vibrio sp. PA-44 and characterised by a high activity at low to moderate temperatures and, due to homology to proteinase K, potentially a broad substrate specificity. Such attributes indicate its potential for use in various applications, among which is the efficient breakdown of protein rich biomass. Presently, this protease is produced in E. coli by batch production and the current study aimed to optimise the batch production process and evaluate the role of key process variables in VPRp productivity. In addition, the protein was to be purified and investigated for use in the breakdown of an insoluble protein substrate. Preliminary investigations of various media and media components suggested 2xYT as the medium of choice due to compatibility with calcium, as required for VPRp stability, and high VPRp production levels. For optimisation of the production process, a multivariate statistical technique, namely, response surface methodology (RSM) with a central composite design (CCD), was employed for experimental design, statistical modelling, evaluation of the applied model, evaluation of process variables and identification of process conditions for maximum VPRp production. The effects of the process variables: IPTG concentration, time of induction and induction period were studied and a quadratic model with a p-value of < 0.01 applied to describe the dataset and predict the response variable. The time of induction and induction period were shown to be critical for VPRp production. Using the quadratic model, the optimum process variable conditions were identified as induction with 1.35 mM IPTG at 15.2 h incubation for a 34.4 h induction period. An abridged three-step purification protocol was developed to purify intracellularly produced VPRp and enabled the obtention of 217 mg of pure protease per litre of production culture. A comparative investigation of VPRp activity in solubilising an insoluble protein substrate indicated highest activity with this enzyme as compared to three commercial protease preparations. It was 1.7-fold more active than its mesophilic homolog proteinase K under the moderate temperature (25 °C) conditions used, while the other proteases only demonstrated residual or no activity. Such observations show promise for future studies and may be resultant of the high activity cold adapted characteristics of VPRp combined with a broad substrate specificity.Collins, TonyKristjánsson, Magnús MárUniversidade do MinhoGonçalves, Ricardo Daniel Gavina2020-01-282020-01-28T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttps://hdl.handle.net/1822/80448eng202474151info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-12-16T01:18:52Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/80448Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T19:18:03.854685Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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