Novas abordagens para o tratamento da fenilcetonúria: avaliação em modelos celulares de formulações da fenilcetonúria hidroxilase humana

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Gomes, Kátia Cristina Morais Soares
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/26534
Resumo: Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016
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spelling Novas abordagens para o tratamento da fenilcetonúria: avaliação em modelos celulares de formulações da fenilcetonúria hidroxilase humanaFenilcetonúriaFenilalanina hidroxilaseTerapia enzimática de reposiçãoNanoencapsulaçãoTeses de mestrado - 2016Departamento de Química e BioquímicaTese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016A Fenilcetonúria (PKU; OMIM 261000) é o erro hereditário mais comum do metabolismo dos aminoácidos afetando, na população Caucasiana, cerca de 1 em cada 10.000 recém-nascidos. Esta doença genética tem como base mutações no gene que codifica para a fenilalanina hidroxilase humana (hPAH; EC 1.14.16.1), uma enzima que catalisa a hidroxilação da fenilalanina (L-Phe) em tirosina (LTyr) na presença do cofator tetra-hidrobiopterina (BH4) e do oxigénio molecular (O2). De modo a evitar danos cerebrais irreversíveis deve ser instaurada uma dieta pobre no aminoácido essencial L-Phe o mais cedo possível após o nascimento. Até muito recentemente a terapia dietética era a única abordagem disponível para o tratamento dos doentes PKU. Uma vez que a PKU pode ser considerada uma doença conformacional por loss of function nos últimos anos surgiu uma alternativa terapêutica que envolve administração do cofator enzimático BH4 como chaperone farmacológico. No entanto, estas duas abordagens terapêuticas estão longe de abranger todo o espectro fenotípico da doença, em especial o fenótipo de PKU clássica, mais grave. Os grupos Metabolism and Genetics (Met&Gen) e Nanostructured Systems for Overcoming Biological Barriers (Nano2B) do Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa), têm estado envolvidos no desenvolvimento de uma nova abordagem terapêutica designada por terapia enzimática de reposição (ERT). Neste âmbito foi já possível obter uma forma estável da hPAH e desenvolver um sistema de nanopartículas (NP) de quitosano (CS) adequado para a encapsulação da forma selvagem da hPAH (hPAHwt). Assim, o presente trabalho teve como objetivo verificar a eficácia das formulações obtidas por ensaios de uptake em células apropriadas nomeadamente, células HEK-293T (human embryonic kidney 293T cells). Uma vez que estas células não expressam hPAH a aquisição de capacidade hidroxilante da L-Phe no lisado celular poderá confirmar o sucesso das formulações desenvolvidas. Assim, a proteína hPAHwt foi produzida num sistema de expressão procariota e a sua forma tetramérica biologicamente ativa foi isolada utilizando técnicas de cromatografia de afinidade e de exclusão molecular. A proteína recombinante produzida foi caraterizada a nível da sua atividade enzimática e estabilidade térmica (Tm) por fluorimetria diferencial de varrimento (DSF). De entre as formulações previamente otimizadas no laboratório, foi selecionada a formulação de NP-CS e cinco outras formulações onde foram utilizados diferentes agentes modificadores. Estes, por questões de confidencialidade, foram designados por 1, 2, 3, 4 e 5 por (NP-CSAgm1, NP-CSAgm2, NP-CSAgm3, NP-CSAgm4 e NP-CSAgm5). Para preparação das NPs com os agentes modificadores 1, 2 e 3 foram ainda ensaiadas cargas baixas (Agmcb) e altas (Agmca). Após caraterização das NPs e do perfil de libertação das formulações em estudo foram então efetuados os ensaios em células. Após nanoencapsulção da hPAHwt nos diferentes sistemas, a avaliação da atividade catalítica e do Tm permitiu confirmar que esta mantinha a sua funcionalidade (74,3 ± 5,7% de atividade relativa) e estabilidade. A caracterização das NPs indicaram que estas apresentavam propriedades adequadas à sua utilização no que respeita ao tamanho de partícula (221 ± 24 nm), potencial zeta (+26,1 ± 2,4 mV) e eficiência de encapsulação (EE; 78,6 ± 2,8%). Os ensaios de libertação efetuados demonstraram que todas as formulações, exceto a NP-CSAgm2ca, mantinham constantes o valor de proteína no sobrenadante dos ensaios. Assim, de entre as nove formulações foram selecionadas quatro (NP-CS, NPCSAgm3ca, NP-CSAgm4 e NP-CSAgm5) para os ensaios com células HEK-293T. Uma vez que não foi possível detetar hPAHwt na fração solúvel do lisado celular estendemos os nossos ensaios às células HepG2 (human hepatocellular carcinoma cell line, ATCC HB-8065). De entre as formulações testadas duas apresentaram capacidade de serem internalizadas pelas células HepG2 nomeadamente a NP-CS e a NP-CSAgm5 uma vez que o teor de hPAHwt detetado no sobrenadante do lisado, após 6 h de incubação a 37 °C, foi de 26,2% e 8,2%, respetivamente. Os resultados obtidos neste trabalho são extremamente promissores e abrem a porta a novos estudos que poderão ter como objetivo a modificação da superfície das NPs para melhorar o seu uptake celular.Phenylketonuria (PKU; OMIM 261000) is the most frequent inborn error of amino acid metabolism with an estimated incidence of 1:10,000 newborns, in the Caucasian population. This genetic disease is the result of mutations in the gene encoding the human phenylalanine hydroxylase (hPAH; EC 1.14.16.1). This enzyme is responsible for the hydroxylation of L-phenylalanine (L-Phe) into L-tyrosine (L-Tyr) in the presence of the tetra-hydrobiopterin cofactor (BH4) and the molecular dioxygen (O2). In order to avoid irreversible neurological damages a diet restricted in L-Phe should be implemented as soon as possible after birth. Till very recently this diet was the only available approach to PKU treatment. As PKU is now classified as a conformational disorder with loss of function, in the last years an alternative therapeutic approach was developed involving BH4 administration as a pharmacological chaperone. However, these therapeutic approaches are far from including the full phenotypic spectra of the disease and in particular the most severe classical form. The groups of Metabolism and Genetics (Met&Gen) and Nanostructured Systems for Overcoming Biological Barriers (Nano2B), from the Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa), have been involved in the development of an enzyme reposition therapy (ERT) as a new approach to PKU treatment. In this scope the groups already obtained a stable form of hPAH and developed a chitosan (CS) nanoparticulate (NP) system allowing an efficient encapsulation of the wild-type hPAH (hPAHwt). As such, this work aimed at verify the efficacy of the designed formulations by performing uptake assays in appropriate cells namely HEK-293T cells (human embryonic kidney 293T cells). Since, hPAH is not expressed in these cells acquisition of a L-Phe hydroxylating capacity by the cellular lysate should confirm the success of the developed formulations. To this end, the hPAHwt was produced in a prokaryotic expression system and the biological active tetrameric form was purified using two chromatographic techniques namely affinity chromatography and size exclusion chromatography. The obtained recombinant protein was characterized concerning its catalytic activity and thermal stability (Tm) using differential scanning fluorimetry (DSF). Among the formulations previously optimized in our laboratory, we selected for further cellular studies the NP-CS and five additional formulations prepared using modifying agents. These agents were named 1, 2, 3, 4 and 5 (NP-CSAgm1, NP-CSAgm2, NP-CSAgm3, NP-CSAgm4 and NP-CSAgm5) due to confidentiality issues. When using the modifying agents 1, 2 and 3 a low (Agmcb) and a high (Agmca) loading were also tested. After characterization of NPs and their release profile cellular studies were then performed. Upon hPAHwt nanoencapsulation using the nine different systems, evaluation of the specific enzymatic activity and Tm allowed to confirm that the protein maintained functionality (74.3 ± 5.7% of relative enzyme activity) and stability. The NPs physicochemical characterization showed that the formulations presented adequate properties to be further used in the cellular assays in respect to NP size (221 ± 24 nm), zeta potential (+26.1 ± 2.4 mV) and encapsulation efficiency (EE; 78.6 ± 2.8%). The release assays indicated that all but one (NP-CSAgm2ca) of the tested formulations allowed to maintain a constant value of the protein in the supernatant of the assays. Therefore, among these nine formulations four (NP-CS, NP-CSAgm3ca, NP-CSAgm4 e NP-CSAgm5) were selected for further HEK-293T cellular assays. Since, no hPAHwt protein was detected in the soluble fraction of the cellular lysate additional assays were performed using HepG2 cells (human hepatocellular carcinoma cell line, ATCC HB-8065). Among the four formulations studied, two showed to present the capacity to be internalized by the HepG2 cells namely NP-CS and NP-CSAgm5 as the content of the hPAHwt protein detected in the supernatant of the cellular lysate, after 6 h incubation at 37 °C, was 26.2% and 8.2%, respectively. The results obtained in this work are very promising and pave the way to additional studies aiming to modify the NP surface in order to improve their cellular uptake.Leandro, Ana Paula Costa dos Santos Peralta, 1961-Pinto, Francisco RodriguesRepositório da Universidade de LisboaGomes, Kátia Cristina Morais Soares2018-12-24T01:30:20Z201620162016-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/26534TID:201690438porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:16:46Zoai:repositorio.ul.pt:10451/26534Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:43:10.999634Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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