The role of electrostatics in the mechanism of ATP/ADP carrier function: an in silico study

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Oliveira, Nuno Filipe Baltazar Maia Costa de
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/48030
Resumo: Tese de mestrado em Bioquímica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020
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spelling The role of electrostatics in the mechanism of ATP/ADP carrier function: an in silico studyDinâmica MolecularCpHMDUmbrella SamplingForça ElectrostáticaTransportadores de MembranaTeses de mestrado - 2020Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de mestrado em Bioquímica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020As forças electrostáticas têm um papel fulcral numa extensa panóplia de processos biomoleculares desde expressão de genes, resposta imune, condução de moléculas até centros catalíticos, acoplamento de subunidades, entre outros. A grande ubiquidade destas prende-se com a sua habilidade de actuarem a longas distâncias. Assim sendo, a capacidade de descrever as forças electrostáticas associadas aos diversos processos é uma ferramenta extremamente útil, porém, infelizmente, o seu estudo com detalhe atomístico é bastante difícil de realizar através de métodos experimentais. Desta forma os métodos computacionais têm vindo a ganhar relevância tanto pelo grande aumento de poder computacional nas últimas décadas, como também pela sua capacidade de colmatar esta lacuna a nível experimental. Com isto em mente, o presente trabalho pretende demonstrar um protocolo computacional efectivo no estudo das propriedades electrostáticas de sistemas moleculares de grandes dimensões e complexidade. O objecto de estudo escolhido para a validação deste protocolo foi a proteína transportadora de ATP/ADP (AAC), responsável por importar o ADP para a matriz mitocondrial e exportar ATP da matriz para o espaço inter-membranar do mitocôndrio. Sendo capaz de atrair e transportar moléculas altamente negativas aponta imediatamente para a presença de uma superfície electrostática complexa e essencial para que o processo ocorra eficientemente. A somar às características mencionadas anteriormente, o facto deste transportador estar bem caracterizado e estudado torna-o um bom candidato a usar na demonstração de um protocolo de estudo da electrostática associada a processos biomoleculares. Para concretizar este estudo três técnicas computacionais foram utilizadas funcionando em complementaridade. Primeiramente simulações longas de dinâmica molecular foram realizadas, após a inserção do transportador de ATP/ADP em membranas de POPC. Com estas torna-se possível avaliar a estabilidade do nosso sistema proteína-membrana, verificando a viabilidade das condições escolhidas. Efectivamente foi observado que o uso do método de campo de força generalizado para o tratamento da electrostática a longa distância introduziu instabilidades estruturais nas simulações. Assim, foi necessário readaptar o nosso protocolo aplicando o método de somas de Ewald com malha de partículas para o tratamento da electrostática a longa distância. Procedendo a esta alteração no tratamento das nossas simulações torna-se possível equilibrar o nosso sistema de modo a ser empregue na técnica de Dinâmica Molecular a pH Constante (CpHMD). Esta acrescenta um nível de detalhe à descrição do sistema ao permitir a ocorrência de eventos de (des)protonação numa lista definida de moléculas e/ou resíduos de aminoácido. Realizando simulações de CpHMD em ambos os estados, C e M, do AAC em forma apo e a quatro valores de pH, 4, 5, 6 e 7, torna-se possível obter curvas de titulação e valores de pKa para diversos aminoácidos presentes no transportador de membrana. Analisando a presença de desvios nos pKa detectados nas nossas simulações de CpHMD torna-se possível a discussão acerca do seu ambiente circundante e de possíveis interacções electrostáticas entre resíduos da proteína. Destas simulações fomos capazes de identificar um grande desvio no pKa da lisina 22, trazendo o seu valor de 10.4, quando solvatado, para ∼ 8. Este desvio fora já reportado em publicações anteriores e, à semelhança do nosso trabalho, demonstra-se relevante para a actividade do transportador, uma vez que a forma protonada deste resíduo é essencial à actividade. Das nossas análises foi também possível identificar três resíduos ácidos na proteína cujo pKa se encontrava desviado para valores inferiores no estado C do AAC. Este desvio indica-nos a presença de interacções electrostáticas que estabilizam o estado carregado dos resíduos glutamato 29, aspartato 134 e aspartato 231. Efectivamente estas interacções consistem na formação de pontes salinas que ajudam no fecho da cavidade do AAC no estado C. Com estes resultados é possível demonstrar a utilidade do estudo de uma proteína através da técnica de CpHMD, sendo possível identificar resíduos chave para a actividade do transportador e interações cruciais para o bom funcionamento da proteína. Finalmente, pretendemos não só estudar a forma apo do AAC mas também o processo inteiro de transporte dos substratos através da proteína transmembranar com o intuito de obter uma descrição energética do processo e em simultâneo captar informações acerca das forças electrostáticas envolvidas neste. No entanto, as simulações tanto de MD como de CpHMD apenas são viáveis em pequenas escalas temporais, à volta de poucos microssegundos, já o tempo total do processo de transporte poderá chegar aos milissegundos. De forma a contornar este problema, será usada uma técnica de amostragem aumentada, Umbrella Sampling (US). Nesta, o processo de transporte é dividido em várias janelas segundo uma coordenada de reação e um potencial de enviesamento é aplicado ao substrato para o manter na posição definida. Desta forma, somos capazes de extrair a descrição energética do processo e os perfis de protonação não só do substrato como também dos resíduos do transportador de ATP/ADP. Conjugando os resultados dos dois tipos de transporte, importação de substrato para a matriz e exportação de substrato da matriz, para cada substrato, ATP e ADP, é possível comparar a totalidade de condições de transporte e esclarecer detalhes acerca do mecanismo executado pela proteína. Com as nossas simulações foi possível concluir que o mecanismo de importação dos substratos beneficia de diversos detalhes que não se encontram presentes no processo de exportação. Em primeira instância, através dos resultados obtidos da força potencial média (PMF) e da protonação de ambos os substratos, identificou-se a presença de um maior potencial electrostático positivo na cavidade do estado C, responsável pela captação de substrato no processo de importação. Este potencial conseguirá atrair os substratos do citoplasma para a cavidade a maiores distâncias do que o estado M. Aquando da comparação dos perfis energéticos de importação, foi observada a preferência energética da importação de ADP pelo seu perfil energético inferior relativamente ao do ATP. Já no caso da exportação, ambos apresentam perfis bastante semelhantes, não havendo um favorecimento do transporte de um substrato em particular. Por fim, os dois processos de transporte distinguem-se entre si também ao nível das redes de pontes salinas que executam o fecho da cavidade do estado C e M. Considerando o processo de importação, onde o estado C é responsável pela atração das moléculas, verificou-se a existência da rede de pontes salinas directamente no fundo da cavidade. Esta é constituída pelos resíduos ácidos mencionados nos resultados do CpHMD, Glu29, Asp134 e Asp231. Foi verificado que, ao ocorrer a aproximação do substrato ao fundo da cavidade do estado C, estes ácidos têm tendência a protonarem, o que leva, por consequência, ao enfraquecimento das pontes salinas e a uma mais rápida transição conformacional do estado C para o estado M. Em contrapartida, no processo de exportação, onde o estado M é responsável pela atracção dos substratos, a localização das pontes salinas encontra-se na extremidade citoplasmática da proteína, sendo assim insensível à presença do substrato no fundo da cavidade. Estas características distintas entre o estado C e M, relevantes para o processo de importação e exportação respectivamente, desenham um panorama que evidencia maior dificuldade na importação de substratos. In vivo, este processo é realizado ao atrair o ADP de um meio vasto e escasso em substrato junto da abertura do AAC para o interior da cavidade do estado C. Desta forma, a existência de um maior potencial positivo na cavidade, capaz de captar efectivamente o substrato, a presença de uma armadilha energética que previne a libertação natural do ADP de volta para o meio envolvente e uma mais rápida transição conformacional devido ao enfraquecimento das pontes salinas, aquando da aproximação do substrato, são características essenciais para que o processo de importação se dê com a eficiência e rapidez necessárias. Em contraste, no processo de exportação, o estado M atrai o ATP da matriz mitocôndrial, cujo volume é mais reduzido e onde existe uma grande abundância de substrato. Desta forma este estado não é submetido à pressão do ambiente para evoluir no sentido de aumentar a rapidez e eficiência do transporte, reflectindo-se na ausência das características observadas no estado C. Concluindo este trabalho, foi-nos possível demonstrar como o uso de técnicas computacionais permite um estudo detalhado e intensivo de um sistema de grandes proporções e complexidade, fornecendo informações cruciais acerca das forças electrostáticas e obtendo perfis energéticos que auxiliam na construção do mecanismo de acção da proteína. No presente caso, o protocolo foi usado numa proteína bem estudada e muito do seu mecanismo já fora elucidado. Porém, a aplicação deste mesmo protocolo numa proteína menos estudada poderá vir a revelar importantes detalhes sobre o seu mecanismo e levar à identificação de detalhes estruturais essenciais à actividade da proteína.To accurately describe the electrostatic interactions with atomistic detail is an exceedingly useful tool, since they play a major role in all biomolecular processes. In the present work, we introduced a new computational protocol based on Constant pH Molecular Dynamics (CpHMD) coupled to an Umbrella Sampling scheme (US-CpHMD). Using these techniques, we modeled the conformational changes of ATP/ADP carrier (AAC) coupled to the most relevant protonation events and even extracted the equilibrium energetics involved in the transport of ATP and ADP across the inner mitochondrial membrane. The transport activity of this protein is deeply connected with electrostatic interactions involved in the binding of the highly negative charged substrates. CpHMD simulations were performed on pre-equilibrated apo-AAC:POPC systems, allowing the extraction of titration curves and pKa values of several AAC residues. We were able to reproduce the reported pKa shift of Lys22 from the water soluble pKa value (10.4) to ∼ 8, which makes this residue the responsible for the sensitivity of this protein to basic pH values, modulating the activity of AAC. Three acid aminoacids, Glu29, Asp134 and Asp231, also showed shifted pKa values which revealed their role in establishing electrostatic interactions in the bottom of AAC cavity, forming the matrix salt-bridge network responsible for closing the C-state cavity. Taking a step further, US-CpHMD was used to mimic the transport of substrates while capturing conformational and electrostatic effects. Clear differences between the import and export process were detected in our analysis which are connected to the distinct evolutionary pressures of each transport. The import has developed a larger positive electrostatic potential in the cavity and a clear selectivity towards ADP in order to efficiently capture this molecule. In addition, we observed a substrate-induced shift in the protonation of the acid residues present on the matrix salt-bridge network. This protonation triggers the conformational transition from C- to M-state by weakening the matrix salt-bridges, leading to an acceleration of the import. These characteristics were of high importance for a quick and efficient import process, which is crucial due to the low abundance of the ADP near the C-state cavity. In contrast, from these features only a slightly weaker positive potential was present on the export process. The absence of the other traits is tied with the high abundance of ATP molecules near the M-state cavity and its almost unneeded selectivity over ADP, which is caused by a significantly lower magnitude of evolutionary pressure exerted in this process. Hence the M-state did not develop the same traits as the C-state. The entirety of results showed the success of employing this computational protocol in the analysis of mechanistic details at the atomic level, enabling the extraction of key electrostatic interactions and energetic profiles of the biomolecular process. The application of this protocol to less studied proteins and processes may prove highly advantageous, possibly aiding in the elucidation of their mechanism and key electrostatic details.Machuqueiro, Miguel Ângelo dos SantosRepositório da Universidade de LisboaOliveira, Nuno Filipe Baltazar Maia Costa de2021-05-19T17:04:52Z202020202020-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/48030TID:202695778enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:51:13Zoai:repositorio.ul.pt:10451/48030Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:59:57.843548Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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