Caracterização da miogénese fetal em ratinhos modelo da distrofia muscular laminina 211-deficiente
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| Data de Publicação: | 2019 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | por |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/38274 |
Resumo: | Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019 |
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Caracterização da miogénese fetal em ratinhos modelo da distrofia muscular laminina 211-deficienteMiogénese fetalRatinhoDistrofia muscularPAX7Laminina 211Teses de mestrado - 2019Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019A distrofia muscular congénita merosina-deficiente tipo 1A (MDC1A) é uma doença autossómica recessiva neuromuscular no qual o paciente apresenta, entre outros sintomas, atrofia severa da musculatura esquelética desde a nascença, devido a uma mutação no gene LAMA2, responsável pela produção da subunidade α2 da laminina. Recentemente, foi demonstrado, com a utilização de ratinhos dyW, um modelo para MDC1A, que a doença se manifesta pela primeira vez durante o desenvolvimento fetal, mais concretamente ao longo da miogénese secundária, visível pela observação que os fetos tem uma redução na área muscular esquelética (Nunes et al., 2017). Esta redução foi acompanhada por uma quebra do número de células Pax7-positivas e miogenina-positivas, sem diferenças significativas no número de miofibras (Nunes et al., 2017). Estes dados apontam para um problema no crescimento muscular epaxial via hipertrofia medeada por células (Nunes et al., 2017). A acrescentar a estes dados, foi observada uma sobre-ativação significativa da via de sinalização JAK-STAT em ratinhos dyW-/- relativamente a ratinhos WT, com 2 dias e 3 semanas de idade, mas também uma sobre-ativação da mesma via em miofibras em cultura, sem a integrina α7β1, importante receptor da laminina 211 (Nunes et al., 2017). A ausência de apoptose observada (Nunes et al., 2017) e a próxima relação entre a via JAK-STAT e a simetria de divisão celular através do PAR complex (Price et al., 2014; Tierney et al., 2014) levou à sugestão de um modelo no qual a ausência de laminina 211 é responsável pela ativação da via de sinalização JAK-STAT e que essa ativação altera o balanço das divisões simétricas versus divisões assimétricas das células Pax7-positivas de forma a haver um aumento nas divisões assimétricas em detrimento das divisões simétricas, reduzindo assim o número de células Pax7- positivas disponíveis para a miogénese secundária (Nunes et al., 2017). Como tal, propusemo-nos à caracterização quantitativa e qualitativa da proliferação celular nas massas musculares e à caracterização da dinâmica da população de células Pax7-positivas em ratinhos dyW durante a miogénese secundária. Quantitativamente pela contagem de células miogénicas proliferativas, qualitativamente utilizando o padrão de imunomarcação para o PAR complex como indicação de simetria versus assimetria destas células ao longo da miogénese secundária. No entanto primeiro, perguntámo-nos se existe uma correta polimerização e deposição de outros componentes da membrana basal muscular, nomeadamente colagénio tipo IV e perlecan, e do componente da matriz intersticial, o colagénio tipo VI, ao longo da miogénese secundária em fetos dyW-/- comparado com fetos heterozigóticos Para essa caracterização quantificámos a intensidade de fluorescência de imunomarcações para colagénio tipo IV, VI e perlecan nos estádios E15.5, E17.5 e E18.5, entre os grupos de ratinhos dyW-/- e heterozigóticos. No entanto, as imunomarcações para colagénio tipo IV, VI e perlecan não mostraram qualquer diferença entre ratinhos dyW-/- e heterozigóticos. Para a caracterização da dinâmica da população de células Pax7-positivas ao longo da miogénese secundária quantificámos o número de células proliferativas em massas musculares epaxiais, através da marcação de EdU por reação Click-it, mas também à imunomarcação de células Pax7-positivas, nos estádios E15.5, E17.5 e E18.5. As duas quantificações foram feitas a partir de cortes adjacentes na zona de interesse de cada feto, de forma a poder, tanto quanto possível, relacionar a proliferação em massas musculares epaxiais com o número de células Pax7-positivas ao longo da miogénese secundária. As quantificações da proliferação celular em massas musculares epaxiais ao longo da miogénese secundária mostraram haver uma tendência para uma menor proliferação em ratinhos dyW-/- relativamente a heterozigóticos no estádio E17.5, sendo que essa tendência deixa de se verificar no estádio E18.5. As quantificações do número de células Pax7-positivas ao longo da miogénese secundária mostraram que em ratinhos dyW-/- há significativamente menos células Pax7- positivas relativamente a heterozigóticos no estádio E17.5, sendo que a E18.5 essa diferença é acentuada. A normalização das quantificações de células EdU-positivas e de células Pax7-positivas, com os dados das áreas totais da musculatura epaxial em Nunes et al., 2017 apontam para uma maior declínio do número de células Pax7-positivas em ratinhos dyW-/- relativamente a ratinhos heterozigóticos nas três massas musculares epaxiais entre os estádios E17.5 e E18.5. Esse declínio pode estar relacionado com a redução na taxa de proliferação em fetos dyW-/- comparado com heterozigóticos entre E15.5 e E17.5 Tentámos de seguida determinar quais das células proliferativas em massas musculares epaxiais eram miogénicas no estádio E17.5 utilizando critérios morfológicos. Estas quantificações mostraram que poderá haver uma perturbação na proliferação tanto nas células miogénicas como nas células não miogénicas. Finalmente, foram feitas imunomarcações conjugadas de Pax7+ e Par3+, e utilizada a presença e disposição de Par3 ao longo da célula Pax7-positiva como proxy de forma a aceder a simetria de divisão destas células. As quantificações dos padrões Pax7+/Par3+, Pax7+/Par3- e Pax7- /Par3+ mostraram que a maioria das células Pax7-positivas em fetos heterozigóticos aparentam dividir-se simetricamente no estádio E17.5 e que não houve diferenças significativas da quantificação dos padrões indicativos de simetria ou assimetria entre ratinhos dyW-/- e heterozigóticos. Sugerimos com este trabalho, que a menor área muscular esquelética dos ratinhos dyW-/- relativamente a heterozigóticos se deve a uma redução precoce (E17.5) na proliferação celular nas massas musculares, que poderá levar a uma redução drástica no número de células Pax7-positivas no fim da miogénese fetal, ao ponto de não haver células suficientes que possibilitem o crescimento normal da massa muscular. No entanto mais estudos são necessários para confirmar esta hipótese.Merosin-deficient congenital muscular dystrophy type 1A (MDC1A) is a neuromuscular disease in which the patient presents severe atrophy of skeletal musculature from birth, due to a mutation in the LAMA2 gene, responsible for the production of the laminin α2 subunit. Recently, it has been demonstrated with the use of dyW mice that MDC1A manifests itself for the first time during fetal development, more specifically along secondary myogenesis, as evidenced by a reduction in the skeletal muscle cross sectional area (Nunes et al., 2017). This reduction was accompanied by a decrease in the number of Pax7-positive and myogenin-positive cells, without significant differences in the number of myofibers (Nunes et al., 2017). These data point to a problem in epaxial muscle growth due to an impairment in cell-mediated hypertrophy (Nunes et al., 2017). In addition, overactivation of JAK-STAT signaling pathway was observed in dyW - / - mice relative to WT mice, at 2 days and 3 weeks of age, as well as overexpression of the same pathway in cultured myofibers without the α7β1 integrin, a major laminin 211 receptor (Nunes et al., 2017). The absence of apoptosis (Nunes et al., 2017) and the relationship between the JAK-STAT signalling pathway and the cell division symmetry through the PAR complex (Price et al., 2014; Tierney et al., 2014) resulted in the suggestion of a model in which the absence of laminin 211 is responsible for the activation of the JAK-STAT signaling pathway and that this activation alters the balance of symmetric versus asymmetric divisions of Pax7-positive cells towards an increase the asymmetric divisions at the expense of symmetric divisions, thus reducing the number of Pax7-positive cells available for secondary myogenesis (Nunes et al., 2017). In this thesis, we set out to perform a quantitative and qualitative characterization of cell proliferation in the muscle masses and a characterization of the population dynamics of Pax7-positive cells in dyW mice during secondary myogenesis. Quantitatively by counting proliferative myogenic cells, qualitatively using the immunoreaction pattern for PAR complex as an indication of symmetry versus asymmetry of these cells along secondary myogenesis. We first asked whether there is a correct polymerization and deposition of the remaining components of the basement membrane in the formation of the Pax7-positive cell niche. For the characterization of basement membrane components along the secondary myogenesis we quantified the fluorescence intensity of immunolabbeling for collagen type IV and perlecan as well as the interstitial collagen type VI, normally present in close association with the basement membrane, between the groups of dyW-/- and heterozygotes at stages E15.5, E17.5 and E18.5. However, immunolabeling for collagen type IV, VI and perlecan did not show any significant difference between dyW-/ - and heterozygous mice. For the characterization of cell proliferation and the dynamics of the Pax7-positive cell population along secondary myogenesis, we quantified the number of proliferative cells in epaxial muscle masses, through the EdU labeling using the Click-it reaction and performed immunolabeling for Pax7-positive cells, at E15.5, E17.5 and E18.5. Both quantifications were made in adjacent sections in the zone of interest of each fetus, so as to be able to, as much as possible, relate proliferation in muscle masses with the the number of Pax7-positive cells along secondary myogenesis. Quantifications of cell proliferation in epaxial muscle masses during secondary myogenesis showed a tendency for less proliferation in mutant relative to heterozygotes fetuses at E17.5, but this trend is no longer seen at the E18.5. Quantifications of the number of Pax7-positive cells along the secondary myogenesis showed that in dyW-/- fetuses there are significantly fewer Pax7- positive cells when compared to heterozygotes at E17.5, and at E18.5 this difference is accentuated. The normalization of the EdU-positive cell and Pax7-positive cell quantifications with data from the total areas of the epaxial musculature from Nunes et al., 2017 point to a greater decline in the number of Pax7-positive cells in dyW-/- relative to heterozygous mice in the these muscles between E17.5 and E18.5. This decline may thus be related to the reduction in the proliferation rate in dyW-/- fetuses compared to heterozygotes between E15.5 and E17.5. We also attempted to determine which of the proliferative cells in the muscles were myogenic at E17.5 using morphological criteria. However, this analysis indicated there may be a reduction in proliferation of both myogenic and non-myogenic cells. Finally, co-immunolabeling for of Pax7 and Par3 was used to assess for differences in symmetric and asymmetric divisions of Pax7-positive cells. The presence of polarized Par3 in Pax7- positive cells was used as a proxy for an asymmetric cell division. The quantifications of the Pax7 + / Par3 +, Pax7 + / Par3- and Pax7- / Par3 + patterns showed that the great majority of Pax7-positive cells in heterozygous fetuses appear to by dividing symmetrically at stage E17.5, but there were no significant differences between dyW-/- and heterozygous mice regarding symmetric or asymmetric divisions. Our results suggest that the smaller skeletal muscle area of dyW-/- mice relative toheterozygotes may be due a precocious reduction in the rate of cell proliferation at E17.5, which leads to a drastic reduction in the number of Pax7- positive at the end of fetal myogenesis, to the point that there are not sufficient cells to allow for the normal growth of the fetal muscles. However, further studies are necessary to verify this hypothesis.Thorsteinsdóttir, Sólveig,1962-Repositório da Universidade de LisboaAndrade, Ricardo dos Santos2019-05-17T16:57:54Z201920192019-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/38274TID:202231046porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:35:55Zoai:repositorio.ul.pt:10451/38274Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:52:07.935150Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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