A long non-coding RNA regulating cellular reprogramming

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Barros, Sara Azevedo
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/24659
Resumo: Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016
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spelling A long non-coding RNA regulating cellular reprogrammingIncRNAsEnvelhecimentoReprogramação celularIPSCZeb2NATTeses de mestrado - 2016Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016A compreensão do processo de envelhecimento é fundamental para podermos contrariar e prevenir os efeitos adversos deste no declínio de células e tecidos. O envelhecimento é uma condição geral da vida. Com o passar do tempo, devido à acumulação de modificações genéticas e epigenéticas, as células estaminais tendem a perder a sua capacidade de proliferação e diferenciação, deixando de conseguir substituir tecidos danificados. Em 2006, a descoberta de uma nova forma de reprogramação celular trouxe-nos a promessa da possibilidade de obtenção de células estaminais pluripotentes induzidas (células iPS, iPSC) a partir de células adultas do próprio indivíduo/paciente [34]. Nesta técnica, factores de transcrição ligados à pluripotência são introduzidos e expressos em células diferenciadas, levando-as a reprogramar. Contudo, embora este seja um processo muito promissor, há ainda questões que têm de ser afinadas, nomeadamente a introdução destes factores através de retro/lentivírus e o facto de alguns deles estarem relacionados com tumores. Até à data já se registaram alterações relevantes para a segurança desta técnica de reprogramação e, em 2014, as células iPS foram já utilizadas no tratamento de uma paciente com degeneração macular. No entanto, à medida que as células adultas envelhecem, tornam-se cada vez mais difíceis de reprogramar. Desta forma, este projecto explora o interessante mundo dos RNAs longos não codificantes (conhecidos na língua Inglesa como long non-coding RNAs - lncRNAs) e a sua aplicação na reprogramação celular. Temos um interesse particular em transcritos antisense naturais (NAT), transcritos da cadeia oposta à cadeia codificante, visto que são menos estudados do que outros RNAs não codificantes e tem a capacidade de controlar o seu gene correspondente. Para tal, seleccionamos o lncRNA Zeb2NAT, o transcrito antisense natural (NAT) do Zeb2 (Beltran et al., 2008). O primeiro intrão do gene Zeb2 contém um sitio de entrada de ribossoma interno (IRES - internal ribosomal entry site) que sofre splicing na ausência do Zeb2NAT. No entanto, a presença deste transcrito parece de alguma forma garantir que este intrão não sofra splicing, levando a que a proteína Zeb2 seja transcrita correctamente. A proteína do Zeb2 está envolvida na down-regulation da E-caderina após a transição epitélio-mesênquima, um facto de grande importância dado a transição oposta - transição mesênquima-epitélio - ser um requisito inicial para a reprogramação celular de fibroblastos. A hipótese deste trabalho consiste na afirmação de que a manipulação do lncRNA Zeb2NAT aumenta a reprogramação celular. Para a análise da reprogramação celular foram utilizados fibroblastos adultos e embrionários retirados de ratinhos transgénicos reprogramáveis com uma cassete activada pela doxiciclina, que inclui uma sequência de quatro factores de transcrição ligados à pluripotência - Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc (Takahashi & Yamanaka, 2006). Os nossos resultados mostraram que o knockdown do Zeb2NAT utilizando LNA GapmeRs específicos, uma tecnologia livre de vírus, levou a um aumento no número de colónias de células iPS formadas, especialmente em células envelhecidas. Mostramos também uma linha temporal da reprogramação celular, usando células com diferentes passagens, para mostrar o efeito do envelhecimento celular. De momento estamos a fazer a caracterização das células iPS resultantes através de um ensaio funcional. Demonstrámos pela primeira vez que a manipulação de um lncRNA NAT pode aumentar a reprogramação de células envelhecidas, destacando a possível contribuição deste trabalho para o melhoramento de futuras terapias baseadas em células reprogramadas específicas de cada paciente. Este trabalho poderá também ajudar a estabelecer modelos celulares de doenças ligadas ao envelhecimento ou de pacientes mais velhos.Understanding the aging process is critical to prevent and counteract the effects of agerelated decline of cells and tissues. Throughout time, due to the accumulation of genetic and epigenetic changes, stem cells tend to lose their capacity to replace damaged tissues. A major breakthrough advance was the identification of a combination of four transcription factors [34], which forced expression revert somatic cells to stem-like pluripotent cells (named cellular reprogramming). However, as differentiated cells grow old, they become more and more difficult to be converted back to pluripotency. This project delves into the interesting world of long non-coding RNAs (lncRNAs) and its implications in cellular reprogramming. We are particularly interested in natural antisense transcripts (NATs), transcribed from the opposite strand of coding genes, since they are less studied than other non-coding transcripts and have the capacity of controlling its corresponding proteincoding gene. We selected the lncRNA Zeb2NAT, the natural antisense transcript of Zeb2 (Beltran et al., 2008). It has been previously described that the presence of Zeb2NAT allows Zeb2 to be translated correctly. Zeb2 is involved in the down-regulation of E-cadherin after epithelial-to-mesenchymal transition, a fact of great importance since the opposite transition, mesenchymal-to-epithelial transition, is an early event during cellular reprogramming of fibroblasts. Our hypothesis states that targeting Zeb2NAT enhances reprogramming of aged cells. For the reprogramming assay we used embryonic and adult fibroblasts of a transgenic mouse model carrying a doxycycline-inducible cassette with the four Yamanaka’s factors (Takahashi & Yamanaka, 2006). Our results show that the highly-efficient knockdown of Zeb2NAT with specific and virus-free LNA GapmeRs led to a significant increase in the number of induced pluripotent stem cells (iPS cells) colonies formed, especially in aged cells. We also documented a reprogramming timeline of cells with different passages, showing the effect of cellular aging. At the moment we are characterizing the resulting iPS cell colonies to assess true stemness features. We demonstrated for the first time that a lncRNA NAT can enhance cellular reprogramming of aged cells, highlighting the novelty and possible contribution of this work to improve the development of future stem cell-based therapies using patient-specific cells. This will also allow to make disease models from elderly patients and to optimize culture conditions to expand stem cells.Jesus, Bruno Miguel Bernardes de,1980-Rodrigues, Maria Gabriela,1965-Repositório da Universidade de LisboaBarros, Sara Azevedo2016-09-13T15:46:52Z201620162016-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/24659TID:201330091enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:13:44Zoai:repositorio.ul.pt:10451/24659Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:41:45.529406Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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