The role of lipid membranes in the mechanism of action of sifuvirtide and other HIV-1 fusion inhibitors
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| Data de Publicação: | 2012 |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/7113 |
Resumo: | Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2012 |
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The role of lipid membranes in the mechanism of action of sifuvirtide and other HIV-1 fusion inhibitorsHIV-1Fusão da membranaLípidosLípidos da membranaTeses de doutoramento - 2012Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2012The HIV‐1 fusion process, mediated by the viral gp120‐gp41 complex, occurs in extreme confinement between the viral and cellular membranes. The efficacy of HIV‐1 fusion inhibitors (FIs) may, therefore, be related to their ability to interact with membranes. Lipid membranes can serve as catalysts in the mode of action of this class of inhibitors, by providing a local increased concentration of the drugs near the fusion site. Peptide‐based FIs derived from the gp41 C‐terminal heptad repeat domain (CHR) were the main focus of this thesis. These molecules inhibit the HIV‐1 entry by binding to the gp41 N‐terminal heptad repeat domain (NHR), interfering with the formation of the structure responsible for the viral envelope and plasma membrane fusion. Interactions with lipid membranes play an important role for the first and second generation FIs enfuvirtide and T‐1249, seemingly correlating with their molecular activity. Sifuvirtide is a novel HIV‐1 FI in advanced clinical phases. This 36 amino acid residues anionic peptide developed by the pharmaceutical company FusoGen, displays improved antiretroviral activity compared to enfuvirtide and T‐1249, allowing for instance lower and oncedaily dosage regimens. In this work, we started to evaluate the physical chemistry foundations of the interaction of sifuvirtide with biomembrane model systems. The aim was to correlate putative lipid membrane interactions with the structural properties of the peptide and its improved efficacy. Since sifuvirtide has aromatic residues (such as Trp), fluorescence spectroscopy techniques were mostly used. Results showed no significant interaction with both zwitterionic fluid phase liquid‐disordered (ld) and cholesterol‐enriched liquid‐ordered (lo) membranes; however significant partition to ld cationic membranes was observed. Similar results were obtained using a quenching approach with acrylamide. Interaction with gel phase (so) membranes was reported to be selective towards rigid phosphatidylcholines (PC), but no significant interaction for vesicles composed by sphingomyelin and ceramide was observed. Moreover, an adsorption at the surface of so PC was detected by using a differential quenching approach with lipophilic probes, as well as by Förster resonance energy transfer. This interaction is dependent on the ionic strength, which indicates the mediation of electrostatic interactions at the interfacial level. This may also correlate to an interaction of sifuvirtide on packing defects of so lipid bilayers. Structural conformation evaluation using circular vi dichroism reported that sifuvirtide, while predominantly random‐coiled in solution, acquires α‐ helical conformation upon membrane binding. Finally, studies using other biophysical techniques, such as atomic force microscopy (AFM) and dynamic light‐scattering, demonstrated a minimal perturbation of the lipid bilayer structure by sifuvirtide. Altogether, we can conclude that sifuvirtide presents a specific affinity toward rigid PC membranes, acquiring the correct conformation to bind to gp41. Furthermore, as the HIV viral membrane and lipid rafts are enriched saturated PC relative to the host membrane, a specific interaction of sifuvirtide toward those lipids, related to its mode of action and inhibition efficacy, can be hypothesized. Utilizing the anionic properties of sifuvirtide we further designed a putative delivery strategy using cationic liposomes. We proved that cationic liposomes were able to deliver the anionic sifuvirtide to lipid raft and viral membrane vesicle models, showing the capability and the role of lipid membranes in the fusion inhibition process. In order to establish a broader correlation between antiviral efficacy and membrane affinity among FIs, we also assessed the interaction of enfuvirtide (FDA‐approved) and T‐1249 (second‐generation drug) peptides with supported lipid bilayers presenting distinct phase separations, using AFM combined with epifluorescence microscopy. Results indicated an increased roughness, membrane thinning and fluidification of the lipid bilayer at ld domains upon addition of T‐1249, in comparison to enfuvirtide. Furthermore, T‐1249 is also able to insert and disrupt the borders of so rigid domains. T‐ 1249 is a gp41‐derived sequence that possesses both conserved tryptophan‐rich (TRD) and pocketbinding (PBD) hydrophobic domains. While the PBD may increase the amphipathicity of the Nterminal end, the TRD enhances the hydrophobicity of the C‐terminal end. Our results suggest that the increase in membrane affinity may be due to a cooperation of these domains at both ends of the peptide. In contrast, enfuvirtide only yields the C‐terminal TRD and sifuvirtide only has the Nterminal PBD. Therefore, lower interaction may be expected for those peptides in contrast with T‐ 1249. The TRD has an important role in anchoring the FIs on membranes, and this may explain the increased membrane partitions of enfuvirtide and T‐1249, in comparison to sifuvirtide. Overall, the findings in this thesis help to clarify the improved inhibition efficiency of certain FIs, the specific function of structural properties of FIs and, more importantly, the role of lipid membranes in providing a local increased peptide concentration of FIs near the gp41 target site. Ultimately, this work may provide valuable insights for the development of more potent HIV‐1 inhibitors, with increased efficacy and enhanced membrane affinity. Increasing lipophilicity of HIV‐1 FIs is a recent strategy in pharma industries and may be a very relevant improvement in AIDS therapy in the future. vii At the end of this thesis, details about my contribution in several related side‐projects I participated in, such as the study of the membrane interaction of broadly neutralizing anti‐HIV antibodies against the gp41 membrane proximal external (MPER) domain, are also briefly acknowledged. viiiO vírus da imunodeficiência humana‐1 (HIV‐1) é um retrovírus que causa o síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA). O invólucro do HIV‐1 é derivado da membrana plasmática da célula hospedeira e é formado por uma bicamada lipídica enriquecida em colesterol e esfingomielina. Associadas à membrana viral encontram‐se proteínas, responsáveis pelo processo de entrada viral, que formam um complexo glicoproteico denominado gp120‐gp41. Enquanto a gp120 é a proteína responsável pela ligação do virião às células hospedeiras‐alvo (tipicamente linfócitos T), a proteína gp41 é a subunidade responsável pela fusão da membrana viral com a membrana plasmática da célula‐alvo. Moléculas que inibam o processo de entrada e, mais especificamente, o processo de fusão membranar mediado pela gp41 são denominadas de inibidores de fusão (FIs). Como o processo de fusão tem de ocorrer num espaço confinado entre membranas, a eficácia dos FIs pode, portanto, estar relacionada com uma possível afinidade com membranas. Assim sendo, as membranas lipídicas podem desempenhar funções catalisadoras, estando envolvidas no mecanismo de acção desta categoria de inibidores, providenciando um aumento local da concentração de medicamento junto aos receptores envolvidos no processo de entrada. Nesta tese foram estudados inibidores de fusão de origem peptídica, que mecanisticamente se ligam à região NHR da gp41, e estruturalmente são semelhante à região CHR da gp41. Esta categoria de inibidores é conhecida por péptidos C ou inibidores de fusão classe I. Dois exemplos de FIs pertencentes a esta classe são o enfuvirtide e T‐1249, péptidos desenvolvidos pela Roche‐Trimeris. Ambos os péptidos têm vindo a ser amplamente estudados, tendo sido demonstrada a importância das interacções com membranas lipídicas para os seus modos de acção e actividade antiviral. O sifuvirtide, por seu lado, é um novo inibidor de fusão que tem demonstrado resultados clínicos promissores em comparação ao enfuvirtide e T‐1249. Este péptido de 36 resíduos aminoacídicos e carga global negativa foi desenvolvido pela FusoGen Pharmaceuticals, tendo já completado com sucesso os ensaios clínicos de fase IIb. Embora o sifuvirtide tenha maior potência antiviral, no início do meu doutoramento pouco ou nada se sabia acerca da participação de membranas lipídicas no seu mecanismo de acção. Como tal, este projecto de doutoramento iniciou‐se com o intuito de avaliar se o sifuvirtide possuía afinidade para membranas e, se esse fosse o caso, determinar as bases físicoquímicas que regem tal interacção. Como o péptido sifuvirtide possui resíduos aromáticos, especificamente triptofanos (Trp), utilizou‐se maioritariamente técnicas de espectroscopia de x fluorescência para avaliar a sua interacção com sistemas de membrana modelos. Os resultados obtidos não demonstraram uma interacção significativa do sifuvirtide com membranas zwiteriónicas em fase líquido‐desordenado (ld), nem com membranas enriquecidas em colesterol em fase líquidoordenado (lo). Pelo contrário foi observada uma partição significativa do péptido para membranas catiónicas em fase ld. Resultados semelhantes foram obtidos utilizando metodologias de extinção de fluorescência pela acrilamida em solução aquosa. Quanto a interacções com membranas em fase gel (so), foi detectada uma interacção selectiva do sifuvirtide com vesículas lipídicas de fosfatidilcolinas (PC) saturadas. Em oposição, não foram observadas interacções significativas com vesículas compostas por esfingomielina ou ceramida. Quanto à localização do péptido em membranas PC em fase so, foram efectuados estudos de localização por metodologias de extinção de fluorescência com sondas lipófilas, bem como estudos de transferência de energia de Förster. Ambos os estudos indicam que o sifuvirtide possui uma localização superficial, estando adsorvido à superfície de membranas de PC rígidas. A interacção demonstrou ser dependente da força iónica do meio, sendo que para uma maior concentração de sal, existe uma interacção mais pronunciada do péptido com membranas de PC rígidas. Tal facto pressupõe a mediação de factores electrostáticos no processo de adsorção do péptido. Estes resultados também se correlacionam com a interacção do sifuvirtide em falhas de grão, i.e. defeitos de empacotamento, de membranas lipídicas compostas por PC em fase so. Dados estruturais obtidos por espectroscopia de dicroísmo circular revelam que o sifuvirtide em solução aquosa é maioritariamente uma molécula em randomcoil, sendo que adquire conformação em hélice‐α aquando da interacção com membranas. Por fim, estudos biofísicos envolvendo microscopia de força atómica (AFM) e espectroscopia de dispersão dinâmica de luz revelam que o péptido não perturba significativamente a estrutura da bicamada lipídica. Globalmente, pelos resultados obtidos nesta fase do trabalho conseguiu‐se concluir que o sifuvirtide apresenta uma afinidade específica para membranas de PC rígidas, adquirindo a conformação correcta para se ligar aos domínios da gp41 aquando do processo de inibição. Adicionalmente, em comparação com as membranas das células hospedeiras, a membrana viral do HIV bem como as jangadas lipídicas ao nível da membrana plasmática das células hospedeiras (associadas aos receptores necessários para a entrada do HIV) estão enriquecidas em lípidos rígidos tais como esfingomielina e também PC saturados. Assim sendo, pode‐se propor uma interacção específica do sifuvirtide com essas regiões membranares, correlacionada com o mecanismo de acção desta molécula bem como eficácia anti‐retroviral. Dadas as características intrínsecas do péptido sifuvirtide, em especial a sua carga aniónica, foi também desenvolvida uma estratégia de entrega da molécula utilizando lipossomas catiónicos. Foi demostrado que lipossomas catiónicos são vectores xi eficazes para a entrega do sifuvirtide em vesículas que mimetizassem as propriedades das membranas virais e jangadas lipídicas, demostrando em última instância o papel das membranas lipídicas no processo de inibição por parte de FIs. De modo a estabelecer uma correlação mais ampla entre a actividade anti‐retroviral e a afinidade para membranas entre a classe dos FIs, decidimos avaliar a interacção do inibidor de primeira geração enfuvirtide (já aprovado pela FDA) e do inibidor de segunda geração T‐1249 para modelos de membranas suportadas. Tais estudos foram importantes de modo a determinar as condicionantes estruturais envolvidas nesse processo. Para o estudo do enfuvirtide e T‐1249, utilizou‐se uma conjugação de técnicas microscópicas: AFM associada a microscopia de fluorescência. Os resultados desse estudo indicam que após adição de T‐1249, e ao contrário do que acontece com o enfuvirtide, ocorre um aumento da rugosidade membranar, redução da espessura da membrana, bem como fluidificação membranar ao nível das regiões em fase fluida. Adicionalmente, o T‐1249 demostrou ser capaz de se inserir nos limites das regiões em fase so. Tal facto pode ser explicado pela presença de dois domínios hidrófobos enriquecidos em Trp que existem nas extremidades do T‐1249. Esta molécula possui uma sequência sintética derivada da gp41, tendo no terminal amina (N‐terminal) o pocketbinding domain (PBD) e no terminal carboxilo (C‐terminal) o Trprich domain (TRD). Enquanto o PBD aumenta as propriedades anfipáticas da extremidade N‐terminal, o TRD aumenta a hidrofobicidade da extremidade C‐terminal. Os resultados aqui obtidos sugerem que o aumento da afinidade para membranas que o T‐1249 apresenta se deve a uma cooperação sinergística entre esses domínios do péptido. Contrariamente ao T‐1249, o enfuvirtide só possui o domínio TRD no terminal carboxilo e, por outro lado, o sifuvirtide só possui o domínio PBD no terminal amina. Como tal, para ambos esses péptidos é esperado haver uma menor interacção com membranas, o que já foi experimentalmente verificado. O TRD desempenha funções importantes na ancoragem dos péptidos inibidores de fusão a membranas lipídicas, e tal facto pode explicar as fracas partições observadas para o sifuvirtide, em comparação com enfuvirtide e T‐1249. Em suma, os temas investigados e resultados obtidos neste manuscrito ajudam a clarificar o motivo do aumento de eficácia antiviral para certos FIs classe I, dando grande enfoque às propriedades estruturais dessas moléculas, mas sobretudo ao papel desempenhado pelas membranas lipídicas na concentração de inibidores de fusão junto do local onde o processo de entrada ocorre. Em última análise, este trabalho de doutoramento poderá providenciar dados valiosos para o desenvolvimento de inibidores de fusão mais potentes, com maior eficácia e com maior afinidade para membranas lipídicas. O aumento da lipofilicidade dos inibidores de fusão do HIV‐1 tem vindo a ser uma estratégia xii recente aplicada pela indústria farmacêutica e deverá ser relevante no avanço futuro de novas terapias contra a SIDA. No final deste manuscrito, visto ter trabalhado em mais projectos envolvendo AFM, irei apresentar de forma sucinta a minha contribuição em vários desses projectos secundários, como por exemplo, no estudo da afinidade para membranas lipídicas de anticorpos monoclonais contra a região membranar proximal externa (MPER) da gp41. xiiiFundação para a Ciência e Tecnologia (FCT)Castanho, Miguel Augusto Rico Botas,1967-Santos, Nuno C.,1972-Repositório da Universidade de LisboaFranquelim, Henri Girão,1984-2012-10-24T10:46:59Z20122012-01-01T00:00:00Zdoctoral thesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/7113enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-11-20T17:09:52Zoai:repositorio.ul.pt:10451/7113Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openairemluisa.alvim@gmail.comopendoar:71602024-11-20T17:09:52Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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