Adenoviruses' inactivation mechanisms by gamma radiation

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Palma, Catarina Rua
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/39294
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018
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spelling Adenoviruses' inactivation mechanisms by gamma radiationEnteric virusAdenovirusGamma radiationWastewater treatmentTeses de mestrado - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018Adenovirus is the most prevalent enteric virus in waters and inefficiently removed by conventional wastewater treatments leading to public health concerns. The main goal of this thesis project was to study the adenoviruses’ inactivation mechanisms by gamma radiation treatment, through the evaluation of the effects on genome and capsid proteins. The insights on the inactivation of enteric virus via gamma radiation aim to contribute to develop alternative water disinfection treatments. This project addressed ONU sustainable development goals, namely ensure availability and sustainable management of water and sanitation for all. The HAdV-5 was inoculated in PBS and wastewater substrates and irradiated in a Cobalt-60 irradiator at five gamma radiation doses (1.5, 3, 4, 15 and 25 kGy). The amplification of long regions of HAdV-5 genome, the viral proteins abundance and antigenicity and, the infectivity were evaluated for all tested doses. Despite the similar results for the amplification of fragments of viral genome from virus suspensions on PBS and wastewater irradiated at 4 kGy; the proteins abundance and antigenicity, as well as, the viral infectivity were higher for the wastewater substrate. The viral proteins were degraded with different sensitivity to gamma radiation. The HAdV-5 structural proteins of capsid, hexon, penton and fiber showed higher radioresistance to gamma radiation comparatively to other viral proteins. The relative binding of a monoclonal antibody to the hexon antigen on PBS samples was only 17%, contrasting with 88% for wastewater samples. The virus titer log10 reduction when suspended in PBS and wastewater was 6.5 and 5.0, respectively. These differences can be explained by a protective effect of the organic matter present in the wastewater substrate against the indirect effects of gamma radiation. According to the obtained results, the HAdV-5 DNA degradation could be considered the main factor for viral infectivity decreases and virus inactivation. The outputs of this work evidenced that for both substrates a treatment with 4 kGy gamma radiation dose could produce a viral inactivation superior to the conventional wastewater treatments, removing >99,99% of HAdV-5. The understanding of viral inactivation mechanisms by ionizing radiation will provide new insights for application of this technology on wastewater treatments.Um dos objetivos da ONU para o desenvolvimento sustentável é assegurar a disponibilidade e gestão sustentável da água e saneamento para todos. Os vírus entéricos representam um desafio societal mundial ao nível da contaminação de águas para consumo humano. Os vírus entéricos são excretados pelas fezes, transmitidos pela via oral-fecal e replicados no trato gastrointestinal humano. As doenças transmitidas através de água contaminada representam uma mortalidade de 1.5 a 12 milhões de pessoas por ano, das quais uma grande parte é causada por infeções provenientes de água potável contaminada. A constante evolução e variação de serotipos virais conferem aos vírus entéricos uma elevada plasticidade. Em águas contaminadas podem ser encontrados até 150 tipos de vírus entéricos. A elevada diversidade, resistência e infecciosidade conferem a estes vírus uma elevada persistência no meio ambiente. Os vírus entéricos causam infeções no sistema nervoso central, gastroenterites, conjuntivites e doenças respiratórias. Os adenovírus foram considerados um indicador do nível poluição das águas devido à sua elevada resistência a fatores químicos e físicos. As infeções causadas por adenovírus têm uma elevada incidência em crianças e indivíduos imunocomprometidos. Os vários serotipos deste vírus são associados a diferentes infeções, tais como pneumonia (serotipos 3,5 e 7), conjuntivite (serotipos 8,19 e 37) e gastroenterite (serotipos 40 e 41). Nas águas recreativas, o risco de infeção é estimado em cerca de 1 em 1000 para uma única exposição. O principal fator da complexidade e resistência dos adenovírus é considerado a presença de uma cápside cujas principais proteínas são o hexão (pII), pentão (pIII) e a fibra (pIV) que se interligam numa rede complexa. Um dos objetivos deste estudo foi contribuir para a implementação de novas tecnologias de radiação ionizante para o tratamento de efluentes, tendo em conta a documentada ineficiência dos métodos tradicionais no tratamento de vírus entéricos. As tecnologias de radiação são um processo de desinfecção seguro, não térmico, que não recorre a substâncias químicas que podem deixar resíduos, tendo a vantagem do tratamento poder ser realizado diretamente no produto final. A radiação gama emitida pelo radioisótopo cobalto-60 (Co-60) apresenta um elevado poder de penetrabilidade em materiais líquidos e sólidos. Esta tecnologia é globalmente utilizada na esterilização de produtos médicos, produtos alimentares e biológicos conservando as suas caraterísticas e valor nutricional. A inativação microbiana por radiação gama ocorre pelo efeito direto dos fotões no genoma dos microrganismos e indiretamente pela formação de radicais livres provenientes da radiólise da água. Estes radicais por sua vez, podem interagir com o material genómico e produzir quebras simples ou duplas na cadeia de ADN. A degradação do ADN pelo efeito direto e indireto da radiação gama é descrito como o principal fator para a inativação de microrganismos. Os efeitos da radiação podem também ter impacto ao nível das proteínas, nomeadamente na quebra das interações hidrofóbicas e ligações covalentes e não covalentes, responsáveis pela estrutura da proteína. A constituição do meio e a atmosfera de irradiação tem uma elevada influência na resposta dos microrganismos à radiação gama. De uma forma geral, a presença de proteínas, carbohidratos e álcoois num dado substrato protege contra os efeitos da radiação, na medida em que estas moléculas estabelecem ligações com radicais livres impedindo assim a degradação do genoma microbiano. A presença de nitritos, nitratos e quinonas tem o efeito contrário, aumentando a eficiência do tratamento por irradiação. O conteúdo em água e a atmosfera rica em oxigénio são também fatores que sensibilizam os microrganismos à radiação gama. Adicionalmente, o tamanho e complexidade dos microrganismos podem também influenciar a resposta à radiação ionizante, em termos gerais os microrganismos de maior tamanho como as bactérias e fungos, são mais sensíveis à radiação comparativamente com os vírus que são considerados mais radioresistentes. O estudo dos principais mecanismos de inativação de vírus, nomeadamente de adenovírus (adenovírus humano serotipo 5, HAdV-5), pela radiação gama foi o objetivo principal deste estudo. Deste modo, os efeitos ao nível do genoma viral, das proteínas e da infecciosidade viral foram avaliados em dois substratos (PBS e efluente municipal antes do tratamento terciário) de forma a mimetizar possíveis cenários onde o tratamento por radiação ionizante poderá ser aplicado como método de desinfeção de vírus entéricos humanos. As suspensões de HAdV-5 em PBS e efluente foram tratadas por radiação gama às doses 1.5, 3, 4, 15 e 25 kGy e subsequentemente analisadas comparativamente com suspensões não irradiadas. Os efeitos da irradiação ao nível do ADN viral foram estimados por amplificação de dois fragmentos longos do genoma de HAdV-5 por PCR, 1000 pb e 10000 pb. O fragmento de 1000 pb do genoma de HAdV-5 foi amplificado em todas as amostras (não irradiadas e irradiadas), enquanto que a amplificação do fragmento do genoma de maior dimensão 10000 pb não foi detetada para as suspensões virais irradiadas a partir dos 4 kGy. Estes resultados sugerem que a potencial fragmentação do ADN viral por radiação gama deverá ser maioritariamente em fragmentos superiores a 1000 pb, de forma a permitir a amplificação de fragmentos do genoma desta dimensão. Com base nos resultados obtidos e na metodologia aplicada, não foi detetada a influência do substrato de irradiação (PBS vs. efluente) na amplificação de fragmentos do genoma de HAdV-5. Os efeitos da radiação gama nas proteínas virais foram analisados por SDS-PAGE, western-blotting com anticorpo policlonal anti-adenovirus e ELISA com anticorpo monoclonal anti-hexão. A abundância e antigenicidade das proteínas virais decresceu com o aumento da dose de radiação gama aplicada às suspensões virais, contudo as proteínas estruturais pII (hexão), pIII (pentão) e pIV (fibra) demonstraram por western-blotting uma elevada radioresistência, sendo detetadas nas suspensões virais irradiadas a 25 kGy. O efeito do substrato na irradiação foi evidenciado ao nível das proteínas virais. As suspensões virais em PBS apresentaram uma maior degradação proteica comparativamente com as amostras em efluente. A carência química de oxigénio (CQO) é superior no efluente, existindo assim uma maior quantidade de matéria orgânica suscetível à oxidação que confere uma proteção adicional contra os efeitos indiretos da radiação gama (radiólise). A antigenicidade da proteína mais abundante da cápside de adenovírus, o hexão, foi igualmente avaliada para os dois substratos, PBS e efluente, após o tratamento por radiação gama. Para a dose de tratamento de 4 kGy, a percentagem relativa de ligação ao antigénio foi de 17% para as suspensões virais em PBS e de 88% para as amostras em efluente. A infecciosidade das amostras foi medida através da redução do log10 do título viral para ambos os substratos. Considerando a referida dose de radiação de 4 kGy verificou-se uma redução de 6.5 e 5.0 log10 da carga viral nas suspensões em PBS e efluente, respetivamente. Os resultados obtidos indicaram assim uma influência do substrato de irradiação na inativação de adenovírus humano. Relativamente aos mecanismos de inativação por radiação gama, a análise global sugere que a degradação do genoma poderá ser o principal fator, tendo em conta que não foi detetada amplificação de longos fragmentos do genoma associado ao decréscimo da infecciosidade viral nas amostras irradiadas às doses mais elevadas, mas foi observada a presença das principais proteínas estruturais. Os estudos efetuados documentaram a atividade virucida da radiação gama, indicando ser uma tecnologia de desinfeção promissora nomeadamente no tratamento de efluentes. Os tratamentos de efluentes convencionais apenas reduzem a concentração viral em 2 a 3 log10 PFU/ml sendo necessária, segundo a Agência de proteção ambiental, uma redução de pelo menos 4 log10 PFU/ml (99,99% de remoção viral). Considerando, os resultados obtidos nas amostras em efluente irradiadas a 4 kGy verificou-se uma eficiência de inativação superior.Cabo Verde, Sandra Isabel Silva DamasGonçalves, João Manuel BrazRepositório da Universidade de LisboaPalma, Catarina Rua2020-12-05T01:30:18Z2018-12-0520182018-12-05T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/39294TID:202251829enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:37:46Zoai:repositorio.ul.pt:10451/39294Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:53:04.603969Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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