Unveiling aberrancies and neurotoxic properties of ALS astrocytes using unspecific and microglia-specific activation models

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Maurício, Isabel Maria dos Santos
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/63163
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
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spelling Unveiling aberrancies and neurotoxic properties of ALS astrocytes using unspecific and microglia-specific activation modelsSporadic ALSiAstrocytesInflammatory markersAberrant morphologyNeuroinflammationAstrocytic reactivityTeses de mestrado - 2022Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa caraterizada pela perda progressiva dos neurónios motores (NMs) superiores e inferiores no Sistema Nervoso Central, nomeadamente, no cérebro, tronco cerebral e medula espinal. A perda de NMs resulta numa paralisia extensa que começa localmente na musculatura dos membros superiores, inferiores ou bulbar. A ELA é uma doença fatal, com uma sobrevida normalmente de 2 e 5 anos após o diagnóstico. Os doentes sucumbem à doença devido a atrofia muscular grave, paralisia e por fim a desenervação dos músculos respiratórios. É uma doença extremamente heterogénea na sua sintomatologia, e com uma patogénese pouco clara. Atualmente, existem apenas duas abordagens terapêuticas muito limitadas quanto à sua eficácia, tornando-se premente compreender as causas subjacentes e os fatores de risco, de forma a encontrar novos alvos terapêuticos para a ELA. Apesar do envolvimento dos NMs, é bem conhecida a importância da disfuncionalidade das células gliais na doença. Na ELA, os astrócitos alteram a sua forma e padrões de expressão molecular e são referidos como astrócitos reativos ou ativados, perdendo as suas funções benéficas e adquirindo papéis prejudiciais. No entanto, não se sabe qual a causa de tal reatividade e do fenótipo aberrante dos astrócitos na ELA, ou seja, se são intrínsecos à patologia, se são potenciados pela libertação de citocinas da microglia ativada, ou se pelo ambiente neuroinflamatório e seus mediadores. Esta tese teve a possibilidade única de explorar a morfologia e assinatura inflamatória de astrócitos diretamente convertidos de fibroblastos (iAstrócitos) de uma doente com forma esporádica da ELA, em comparação com uma amostra controlo obtida da mesma forma, de uma pessoa não doente, do mesmo sexo e idade (controlo). Para tornar mais evidente as reações de patogenicidade dos astrócitos ELA, foram usados dois estímulos inflamatórios diferentes, ambos descritos na literatura e envolvendo a ação de citoquinas pró-inflamatórias, para atestar qual o mais eficaz na indução do fenótipo aberrante dos astrócitos na ELA. Usámos células induzidas percursoras neurais geradas de fibroblastos da doente e respetivo controlo, cedidas por Kathrin Meyer no âmbito da nossa colaboração, que foram diferenciados em astrócitos induzidos (iAstrócitos), durante 7 dias in vitro. Os astrócitos foram de seguida incubados com as citocinas da microglia ativada (TNF-α/IL-1α/C1q) e as associadas a qualquer processo inflamatório (TNF-α/IL-1β) durante 48 horas. Após este período, recolheram-se as células e o seu secretoma. Os astrócitos da doente com ELA exibiram menos células polarizadas, maior aparência de fibroblastos e menor soma, quando comparados com a amostra controlo, se bem que sem evidência estatística. Esta tendência manteve-se após estimulação com TNF-α/IL-1α/C1q, mas não totalmente com TNF-α/IL-1β, dado que neste caso apenas se verificou a presença de menor soma. A avaliação das propriedades dinâmicas da mitocôndria nos astrócitos, permitiu evidenciar uma diminuição marcada nos astrócitos ELA que se tornaram menos evidentes com TNF-α/IL-1α/C1q e ausentes com TNF-α/IL-1β. Contrariamente ao descrito para os genes associados ao fenótipo aberrante dos astrócitos na ELA, não observámos nos astrócitos ELA o aumento de Cx43, nem de S100B, os quais se apresentaram diminuídos (p<0.01 para ambos), nem qualquer alteração para o transcrito GFAP, habitualmente reduzido. Contudo, identificámos um aumento do marcador de proliferação celular, o Ki-67 (p<0.05). Na presença de TNF-α/IL-1α/C1q, tanto o GFAP como o S100B foram encontrados diminuídos (p<0.05) nos astrócitos ELA. O S100B foi igualmente encontrado diminuído na presença de TNF-α/IL-1β que levou a um aumento marcado da proliferação nos astrócitos ELA. A avaliação de S100B por imunocitoquímica, confirmou a diminuição de S100B nos astrócitos ELA na presença tanto de TNF-α/IL-1α/C1q, como de TNF-α/IL-1β (p<0.05), mas não na ausência destes estímulos. Quanto aos marcadores inflamatórios associados à ativação do inflamassoma, NLRP3, IL1R1 e IL-1β, há a salientar a diminuição dos genes IL-1β e NLRP3 nos astrócitos ELA não estimulados. A redução do NLRP3 foi sustentada na presença de qualquer um dos modelos de estimulação. Os resultados obtidos para os astrócitos da doente com a forma esporádica da ELA apresentam alterações fenotípicas relativamente à amostra controlo, sugestivas de latência e menor capacidade reativa a estímulos, mas mantendo um aumento da capacidade proliferativa, na ausência e presença de TNF-α/IL-1β. Quanto aos efeitos dos dois estímulos testados, nem sempre foram comparáveis. Este trabalho foi pioneiro em mostrar déficits de uma amostra de astrócitos obtidos de doente com ELA, os quais necessitam, contudo, de ser reforçados com um maior número de amostras, incluindo formas familiares. Em suma, o processo inflamatório deverá ser tido em conta na avaliação da patologia associada à ELA e os iAstrócitos sobressaem como uma ferramenta importante na medicina personalizada para esta doença.Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease characterised by the progressive loss of upper and lower motor neurons (MNs) in the central nervous system, namely in the brain, brainstem and spinal cord.The loss of MNs results in extensive paralysis starting locally in the muscles of the upper, lower or bulbar limbs. ALS is a fatal disease, with survival typically between 2 and 5 years after diagnosis. Patients succumb to the disease due to severe muscle atrophy, paralysis, and ultimately the denervation of the respiratory muscles. It is an extremely heterogeneous disease in its symptomatology, and with an unclear pathogenesis. Currently, there are only two therapeutic approaches that are very limited in their efficacy, making it urgent to understand the underlying causes and risk factors in order to find new therapeutic targets for ALS. Despite the involvement of MNs, the importance of glial cell dysfunctionality in the disease is well known. In ALS, astrocytes change their shape and molecular expression patterns and are referred to as reactive or activated astrocytes, losing their beneficial functions and acquiring detrimental roles. However, it is not known what causes such reactivity and the aberrant phenotype of astrocytes in ALS, i.e., whether they are intrinsic to the pathology, whether they are potentiated by cytokine release from activated microglia, or whether by the neuroinflammatory environment and its mediators. This thesis had the unique possibility to explore the morphology and inflammatory signature of astrocytes directly converted from fibroblasts (iAstrocytes) from a patient with the sporadic form of ALS, compared to a control sample obtained in the same way, from a non-diseased person of the same gender and age (control). To make the pathogenicity reactions of ALS astrocytes more evident, two different inflammatory stimuli were used, both described in the literature and involving the action of pro-inflammatory cytokines, to test which was more effective in inducing the aberrant phenotype of astrocytes in ALS. We used induced neural precursor cells generated from patient and control fibroblasts, provided by Kathrin Meyer within our collaboration, which were differentiated into induced astrocytes (iAstrocytes) for 7 days in vitro. The astrocytes were then incubated with the cytokines of activated microglia (TNF-α/IL-1α/C1q) and those associated with any inflammatory process (TNF-α/IL-1β) for 48 hours. After this period, the cells and their secretome were collected. Astrocytes from the ALS patient exhibited fewer polarised cells, greater fibroblast appearance and lower soma, when compared to the control sample, although without statistical evidence. This trend was maintained after stimulation with TNF-α/IL-1α/C1q, but not entirely with TNF-α/IL-1β, as only lower soma was present in this case. Assessment of the dynamic properties of mitochondria in astrocytes, provided evidence of a marked decrease in ALS astrocytes that became less evident with TNF-α/IL-1α/C1q and absent with TNF-α/IL-1β. Contrary to what has been described for genes associated with the aberrant astrocyte phenotype in ALS, we did not observe in ALS astrocytes increased Cx43, nor S100B, which were decreased (p<0.01 for both), nor any change for the usually reduced GFAP transcript. However, we identified an increase in the cell proliferation marker, Ki-67 (p<0.05). In the presence of TNF-α/IL-1α/C1q, both GFAP and S100B were found decreased (p<0.05) in ALS astrocytes. S100B was also found decreased in the presence of TNF-α/IL-1β which led to a marked increase in proliferation in ALS astrocytes. Evaluation of S100B by immunocytochemistry, confirmed the decrease of S100B in ALS astrocytes in the presence of both TNF-α/IL-1α/C1q and TNF-α/IL-1β (p<0.05), but not in the absence of these stimuli. As for the inflammatory markers associated with inflammasome activation, NLRP3, IL1R1 and IL-1β, one should note the decrease in IL-1β and NLRP3 genes in unstimulated ALS astrocytes. The reduction in NLRP3 was sustained in the presence of either stimulation model. The results obtained for astrocytes from the patient with the sporadic form of ALS show phenotypic changes in relation to the control sample, suggestive of latency and lower reactive capacity to stimuli, but maintaining an increased proliferative capacity, in the absence and presence of TNF-α/IL-1β. As for the effects of the two stimuli tested, they were not always comparable. This work was pioneering in showing deficits in a sample of astrocytes obtained from an ALS patient, which need, however, to be reinforced with a larger number of samples, including familial forms. In summary, the inflammatory process should be considered in the assessment of ALS-associated pathology and iAstrocytes stand out as an important tool in personalised medicine for this disease.Research Institute for Medicines, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa; Santa Casa da Misericórdia de Lisboa (SCML), Portugal; Project ref. ALS-Research Grant ELA-2015-002; La Caixa Foundation; Fundación Luzón; Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT),Brites, Dora Maria Tuna de OliveiraBotelho, Ana Rita Mendonça VazRepositório da Universidade de LisboaMaurício, Isabel Maria dos Santos2022-07-272022-07-152025-07-27T00:00:00Z2022-07-27T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/63163TID:203082389enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-03-11T01:18:49Zoai:repositorio.ul.pt:10451/63163Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T03:14:23.587308Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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