Non-invasive viral-mediated gene therapy for Machado-Joseph disease

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Saraiva, Joana Isabel Rajão
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10316/34064
Resumo: SARAIVA, Joana Isabel Rajão - Non-invasive viral-mediated gene therapy for Machado-Joseph disease. Coimbra : [s.n.], 2017. Dissertação de Mestrado
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spelling Non-invasive viral-mediated gene therapy for Machado-Joseph diseaseDoença de Machado-Joseph (DMJ)RNA de interferência (RNAi)Vírus adeno-associado do tipo sérico 9 (AAV9)Administração sistémicaSARAIVA, Joana Isabel Rajão - Non-invasive viral-mediated gene therapy for Machado-Joseph disease. Coimbra : [s.n.], 2017. Dissertação de MestradoMachado-Joseph disease (MJD) is a dominant autosomal neurodegenerative disorder characterized by cerebellar dysfunction and loss of motor coordination. This disorder, which corresponds to the most common type of spinocerebellar ataxia worldwide, is caused by a CAG expansion in the coding region of the MJD1/ATXN3 gene. This mutation is translated into a toxic polyglutamine tract within ataxin-3, which triggers multiple pathogenic mechanisms, ultimately leading to neurodegeneration in several brain regions. The lack of available treatment for MJD encourages further investigation towards possible therapeutic approaches. One of the most direct, specific and effective solutions to correct MJD would be to inhibit mutant ataxin-3 expression using RNA interference (RNAi), thus targeting the initial cause of the disorder. Several studies have already investigated the impact of mutant ataxin-3 silencing in MJD rodent models, through direct administration of viral vectors into the brain parenchyma. This invasive procedure is associated with potential adverse effects and a limited vector distribution in the brain. As a result, a possible translation to human patients would benefit from a non-invasive delivery system, capable of inducing a widespread therapeutic effect throughout the CNS. Therefore, the main goal of this project was to develop a noninvasive viral-based gene therapy for MJD. For that purpose, we selected rAAV9 (recombinant adeno-associated virus serotype 9) as the RNAi delivery vector, since this serotype is able to cross the blood-brain barrier (BBB) and efficiently transduce neurons. Moreover, this viral vector mediates a long-term transgene expression and exhibits a good safety profile, being particularly suitable for CNS gene therapy. Taking all of this into account, we developed an AAV9mediated system encoding an artificial microRNA against mutant ataxin-3 (rAAV9-miR-ATXN3) and test its therapeutic impact in a transgenic mouse model of MJD. Our first task consisted on the validation of this artificial miR sequence in a neuronal cell line. We concluded that miR-ATXN3 mediates an efficient and allele-specific silencing of mutant ataxin-3, providing confidence to studies in vivo. Next, we analyzed the therapeutic potential of rAAV9-miR-ATXN3 vectors in a severely-impaired MJD transgenic mouse model following intravenous (IV) injection at postnatal day 1. Importantly, viral vectors were found to efficiently cross the BBB and transduce neurons throughout the brain of transgenic mice. Moreover, rAAV9 transduction was detected in Purkinje cells, the neuronal population that expresses mutant ataxin-3 in this particular model. Subsequently, we assessed the effects of rAAV9-miR-ATXN3 administration in the behavioral performance of MJD transgenic mice. Noteworthy, this treatment successfully alleviated gait, balance and motor coordination impairments. Finally, we also observed a significant amelioration of neuropathological changes in the cerebellum. Accordingly, rAAV9-miR-ATXN3 treated animals exhibited a reduction in the number of mutant ataxin-3 aggregates, as well as a preservation of molecular layer thickness. Altogether, our results indicate that mutant ataxin-3 silencing through a single AAV9 intravenous injection is an efficient therapeutic approach, alleviating both behavioral and neuropathological impairments. Importantly, our work constitutes the first report of long-term ataxin-3 silencing through a non-invasive viral system, supporting the use of this strategy for MJD therapy.A doença de Machado-Joseph (DMJ) é uma doença neurodegenerativa autossómica dominante, caracterizada por disfunção cerebelar e perda de coordenação motora. Esta doença corresponde ao tipo mais comum de ataxia espinocerebelosa a nível mundial e deve-se a uma expansão do número de repetições CAG na região codificante do gene MJD1/ATXN3. Esta mutação traduz-se numa longa cadeia de poliglutaminas na proteína ataxina-3, o que induz diversos mecanismos patogénicos, causando morte neuronal em várias regiões cerebrais. Neste momento não existe nenhuma terapia disponível para a DMJ. A inibição da expressão da ataxina-3 mutante usando RNA de interferência é uma potencial estratégia terapêutica capaz de corrigir a causa inicial da doença, de uma forma directa, específica e eficaz. Vários estudos investigaram anteriormente o impacto desta estratégia de silenciamento em modelos animais da DMJ, com resultados promissores. No entanto, estas experiências envolveram a administração de vectores virais através de uma injecção intracraniana, ou seja, um procedimento invasivo e associado a efeitos secundários. Além disso, este tipo de administração leva a uma dispersão reduzida dos vectores virais no cérebro. Consequentemente, a opção ideal para facilitar futuras aplicações clínicas seria uma via de administração não invasiva, capaz de induzir um efeito terapêutico em todo o Sistema Nervoso Central. Assim sendo, este projecto teve como principal objectivo desenvolver uma estratégia viral não invasiva capaz de induzir o silenciamento da ataxina-3 mutante, como possível terapia para a DMJ. Para atingir este objectivo, seleccionámos o AAV9 (virus adeno-associado do tipo sérico 9) como vector de entrega da sequência de silenciamento, visto que tem a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica e transduzir neurónios de forma eficaz. Além disso, este vírus induz a expressão dos transgenes durante largos períodos de tempo, sem induzir toxicidade. Neste sentido, desenvolvemos um sistema baseado no AAV9 capaz de codificar um microRNA artificial específico para a ataxina-3 mutante (rAAV9miR-ATXN3) e testámos o seu efeito terapêutico num modelo transgénico da DMJ. Em primeiro lugar, validámos a sequência miR-ATXN3 numa linha celular neuronal, sendo que verificámos um silenciamento eficaz e específico para a forma mutante da ataxina-3. Estes resultados permitiram prosseguir para estudos num modelo animal da doença. Neste contexto, testámos o efeito terapêutico dos vectores rAAV9-miR-ATXN3 em murganhos transgénicos, que receberam uma injeção intravenosa 1 dia após o nascimento. Ao analisar a distribuição do vector, concluímos que ocorreu uma transdução neuronal eficaz em várias regiões do cérebro. De seguida, focámo-nos no cerebelo e em particular nas células de Purkinje, visto que apenas esta população neuronal expressa a ataxina-3 mutante neste modelo. As células de Purkinje mostraram níveis significativos de transdução, indicando que o vector consegue aceder ao nosso principal alvo terapêutico. Consequentemente, avaliámos o efeito desta estratégia no comportamento dos murganhos tratados, sendo que observámos melhorias na coordenação motora e equilíbrio. Além disso, o tratamento permitiu atenuar a neuropatologia no cerebelo, nomeadamente ao reduzir o número de agregados e levando a uma preservação da espessura da camada molecular. Em conclusão, os resultados obtidos após uma única injeção intravenosa de vectores AAV9 indicam que esta é uma estratégia terapêutica eficaz, capaz de atenuar os problemas motores, bem como a neuropatologia. É importante salientar que este foi o primeiro estudo em que se obteve um silenciamento da ataxina-3 mutante a longo prazo e através de uma administração não invasiva, constuindo por isso uma estratégia muito promissora para a terapia da DMJ.2016info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttp://hdl.handle.net/10316/34064http://hdl.handle.net/10316/34064engSaraiva, Joana Isabel Rajãoinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2022-01-21T17:16:59Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/34064Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T20:56:39.913631Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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