Mitochondrial performance during osteoblast differentiation: searching new targets to counteract osteoporosis

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Valente, Sara Cristiana Alves
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10316/87922
Resumo: Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
id RCAP_88715982416d0f18c370327c91053405
oai_identifier_str oai:estudogeral.uc.pt:10316/87922
network_acronym_str RCAP
network_name_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository_id_str 7160
spelling Mitochondrial performance during osteoblast differentiation: searching new targets to counteract osteoporosisPerformance mitocondrial durante a diferenciação de osteoblastos: à procura de novos alvos para contrariar a osteoporoseOsteoporoseOsteoblastoMenopausaEstradiolMitocôndriaOsteoporosisOsteoblastMenopauseEstradiolMitochondriaDissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaA osteoporose é uma doença crónica e assintomática caracterizada pela perda de densidade óssea e pela deterioração estrutural do osso. Isto leva à diminuição da resistência óssea e aumento do risco de fraturas, suscetível de gerar incapacidade física e dependência de terceiros. O decréscimo dos níveis de estrogénios que ocorre nas mulheres após a menopausa aumenta a fragilidade óssea. A osteoporose é, portanto, uma grande preocupação para as mulheres em processo de envelhecimento após a menopausa. O aumento da taxa de perda óssea observada em mulheres na pós-menopausa resulta de um desequilíbrio entre a reabsorção óssea pelos osteoclastos e a formação de novo osso pelos osteoblastos. Como este processo é precedido por uma diminuição nos estrogénios circulantes, este fenómeno poderá ser regulador da atividade e/ou diferenciação das células remodeladoras do osso. As mitocôndrias desempenham um papel importante na função celular dos osteoblastos; no entanto, a interação entre as mitocôndrias, a fisiologia dos osteoblastos, a perda de massa óssea e a sinalização de estrogénios permanece pouco estudada. O principal objetivo deste estudo foi investigar as alterações no metabolismo celular durante a diferenciação de osteoblastos, e como é que o estradiol regula este processo. Para atingir o nosso objetivo, utilizámos células MC3T3-E1 como modelo celular e induzimos a diferenciação em osteoblastos pela adição de 50 μg / mL de ácido ascórbico e 10 mM de β-glicerofosfato na presença e ausência de estradiol. Os resultados obtidos do ensaio de Alizarina S demonstraram que, nas nossas condições experimentais, as células MC3T3-E1 foram capazes de se diferenciar em osteoblastos funcionais capazes de depositar matriz mineralizada. No entanto, como visto pela técnica de Western Blot, os marcadores osteoblásticos Osteocalcina e Runx2 não apresentaram diferenças entre células controlo indiferenciadas e células diferenciadas por 48h. Além disso, pela medição da taxa de consumo de oxigénio (OCR) e da taxa de acidificação extracelular (ECAR) usando um Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer, mostrámos uma diminuição na acidificação do meio (uma medida indireta da via glicolítica) e na respiração mitocondrial durante as fases iniciais da diferenciação osteoblástica (24 e 48h). Os níveis proteicos da enzima mitocondrial superóxido dismutase (SOD2) também diminuíram após 24 e 48 horas de exposição às condições de diferenciação. Além disso, mostrámos evidências de que o E2 na concentração de 10 nM estimulou a mineralização de células MC3T3-E1, enquanto que a deficiência de estrogénios diminuiu a respiração mitocondrial durante as fases iniciais da diferenciação osteoblástica. Os níveis de proteína da SOD2, Sirt3 e TOM20 não foram afetados pela deficiência de estrogénio. Além disso, o número de cópias do mtDNA, conforme determinado por qRT-PCR, não se mostrou afetado pela diferenciação nem pela mimetização de deficiência de estrogénios. Os antagonistas dos recetores de estrogénio ERα (MPP, 10 nM) e ERβ (PHTPP, 10 nM) foram utilizados para estudar o papel de cada recetor de estrogénio na diferenciação e no desempenho mitocondrial nos osteoblastos. Embora os resultados com os antagonistas dos recetores de estrogénio não tenham sido conclusivos em relação à respiração mitocondrial, houve uma clara diminuição na mineralização quando o antagonista do ERα foi adicionado ao meio de diferenciação. A morfologia da rede mitocondrial e o potencial de membrana mitocondrial foram avaliados por microscopia de fluorescência usando o corante TMRM. Os resultados mostraram que estes parâmetros não foram afetados pelos tratamentos com E2, MPP ou PHTPP. Em conjunto, os nossos resultados sugerem que a deficiência de estrogénios leva ao comprometimento do desempenho mitocondrial, revelando a mitocôndria dos osteoblastos como um potencial alvo para terapias de prevenção e tratamento para a osteoporose.Osteoporosis is an asymptomatic chronic disease characterized by a decrease in bone density and by a structural deterioration of the bone. This leads to decreased bone resistance and increased risk of fractures, likely generating physical incapacity and dependence on third parties. Estrogen withdrawal that occurs in women after menopause increases bone fragility. Osteoporosis is thus a major health concern for post-menopausal aging women. The increased bone loss rate seen in postmenopausal women results from an imbalance between bone resorption by osteoclasts and new bone formation by osteoblasts. Since this process is preceded by a decrease in circulating estrogens, this phenomenon may regulate the activity and/or differentiation of bone remodeling cells. Mitochondria play an important role in cellular function in osteoblasts; however, the interplay between mitochondria, osteoblast physiology, loss of bone mass, and estrogen signaling remains poorly understood. The main goal of this study was to investigate alterations in cellular metabolism during osteoblast differentiation and how estradiol (E2) regulates this process. In order to achieve our objective, we used the MC3T3-E1 cell line as a cellular model and induced cell differentiation into osteoblasts by addition of 50 μg/mL of ascorbic acid and 10 mM of β-glycerophosphate in the presence and absence of estradiol. Our results using the Alizarin Red S assay demonstrated that, under our experimental conditions, MC3T3-E1 cells differentiated into functioning osteoblasts capable of depositing mineralized matrix. However, the osteoblastic markers Osteocalcin and Runx2 did not reveal differences between the undifferentiated control cells and their counterparts differentiated for 48h, as shown by Western Blotting. Additionally, by measuring oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) using the Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer, we measured a decrease in media acidification (an indirect measurement of glycolysis fluxes) and mitochondrial respiration during the early phases of osteoblastic differentiation (24 and 48h). The protein levels of mitochondrial superoxide dismutase (SOD2) were also decreased after 24 and 48 hours of exposure to differentiation conditions. Furthermore, we showed evidences that E2 at a concentration of 10 nM stimulated mineralization in MC3T3-E1 cells, while estrogen deficiency decreased mitochondrial respiration during the early stages of osteoblastic differentiation. SOD2, Sirt3, and TOM20 protein levels were not affected by estrogen deficiency. Also, mtDNA copy number, as determined by qRT-PCR, did not show alterations after differentiation nor when mimicking estrogen deficiency. The antagonists of the estrogen receptors ERα (MPP, 10 nM) and ERβ (PHTPP, 10 nM) were used to study the role of each estrogen receptor on differentiation and mitochondrial performance in osteoblasts. Although the results with estrogen receptors’ antagonists were not conclusive regarding mitochondrial respiration, there was a clear decrease in mineralization when the ERα antagonist was added to the differentiation medium. Mitochondrial network morphology and mitochondrial membrane potential were assessed by fluorescent microscopy using the TMRM dye. The results showed that these parameters were not affected by the treatments with either E2, MPP or PHTPP. Together, our results suggest that estrogen deficiency leads to impaired mitochondrial performance, showing that osteoblast mitochondria are a potential target for therapies in order to prevent and treat osteoporosis.Outro - IF/01182/2015/CP1280/CT00072019-09-102025-09-08T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttp://hdl.handle.net/10316/87922http://hdl.handle.net/10316/87922TID:202305864engValente, Sara Cristiana Alvesinfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-10-27T10:54:35Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/87922Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:08:44.388577Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
dc.title.none.fl_str_mv Mitochondrial performance during osteoblast differentiation: searching new targets to counteract osteoporosis
Performance mitocondrial durante a diferenciação de osteoblastos: à procura de novos alvos para contrariar a osteoporose
title Mitochondrial performance during osteoblast differentiation: searching new targets to counteract osteoporosis
spellingShingle Mitochondrial performance during osteoblast differentiation: searching new targets to counteract osteoporosis
Valente, Sara Cristiana Alves
Osteoporose
Osteoblasto
Menopausa
Estradiol
Mitocôndria
Osteoporosis
Osteoblast
Menopause
Estradiol
Mitochondria
title_short Mitochondrial performance during osteoblast differentiation: searching new targets to counteract osteoporosis
title_full Mitochondrial performance during osteoblast differentiation: searching new targets to counteract osteoporosis
title_fullStr Mitochondrial performance during osteoblast differentiation: searching new targets to counteract osteoporosis
title_full_unstemmed Mitochondrial performance during osteoblast differentiation: searching new targets to counteract osteoporosis
title_sort Mitochondrial performance during osteoblast differentiation: searching new targets to counteract osteoporosis
author Valente, Sara Cristiana Alves
author_facet Valente, Sara Cristiana Alves
author_role author
dc.contributor.author.fl_str_mv Valente, Sara Cristiana Alves
dc.subject.por.fl_str_mv Osteoporose
Osteoblasto
Menopausa
Estradiol
Mitocôndria
Osteoporosis
Osteoblast
Menopause
Estradiol
Mitochondria
topic Osteoporose
Osteoblasto
Menopausa
Estradiol
Mitocôndria
Osteoporosis
Osteoblast
Menopause
Estradiol
Mitochondria
description Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
publishDate 2019
dc.date.none.fl_str_mv 2019-09-10
2025-09-08T00:00:00Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv http://hdl.handle.net/10316/87922
http://hdl.handle.net/10316/87922
TID:202305864
url http://hdl.handle.net/10316/87922
identifier_str_mv TID:202305864
dc.language.iso.fl_str_mv eng
language eng
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/embargoedAccess
eu_rights_str_mv embargoedAccess
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron:RCAAP
instname_str Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron_str RCAAP
institution RCAAP
reponame_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
collection Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository.name.fl_str_mv Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1799133980791930880

Registros relacionados