Restoring drug resistant mycobacteria susceptibility to Beta-lactam antibiotics

• Autor(a) principal: GAMA, Bianca Carolina Ribeiro
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/116356
• topic: Ciências biomédicas; Microbiologia médica; Biologia molecular; Micobacterias; B-lactam; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas

A tuberculose (TB) é uma das 10 principais causas de morte no mundo, e o surgimento de estirpes de Mycobacterium tuberculosis multirresistente (MDR) e extensivamente resistente a medicamentos (XDR) é um grande problema de saúde pública. O uso de antibióticos que normalmente não são incluídos no tratamento da tuberculose tem sido considerado, e estudos recentes destacaram o uso de β-lactâmicos, como os carbapenemos, no tratamento da MDR-TB. Os carbapenemos são uma subclasse dos antibióticos β-lactâmicos, que têm como alvo a biossíntese do peptidoglicano e que são particularmente resistentes à inativação pela β-lactamase BlaC, produzida por M. tuberculosis. As micobactérias têm um envelope celular característico, constituído por uma camada de ácidos micólicos de cadeia longa, um polissacárido de arabinogalactano altamente ramificado e uma malha de peptidoglicano reticulada e modificada. Essa barreira contribui para a virulência, persistência e resistência intrínseca das micobactérias a vários antibióticos e modula a resposta imune do hospedeiro. O objetivo desta tese foi estudar como a exposição à isoniazida e ao etambutol - antibióticos que inibem a síntese de ácidos micólicos e arabinogalactano - leva ao aumento da acessibilidade do peptidoglicano aos antibióticos que inibem a sua biossíntese, os β-lactâmicos. Para este fim, foram determinadas concentrações mínimas inibitórias e bactericidas (MIC e MBC) de β-lactâmicos (amoxicilina, cefotaxima, meropenem e imipenem), isoniazida e etambutol para quatro espécies de micobactérias (Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium bovis e Mycobacterium tuberculosis). Todas as espécies mostraram-se suscetíveis a pelo menos um dos β-lactâmicos testados, com melhor eficácia registada para o meropenem, e o clavulanato – um inibidor de β-lactamases – foi essencial para o aumento da atividade dos β-lactâmicos. Adicionalmente, verificámos se a exposição de micobactérias à isoniazida ou ao etambutol em duas sub-MIC (½ MIC e ¼ MIC) e subsequente e/ou simultânea exposição a β-lactâmicos poderia melhorar a sua eficácia. Notavelmente, o etambutol teve um efeito potencializador da atividade dos β-lactâmicos, com as MICs da amoxicilina e do meropenem significativamente mais baixas quando combinados com etambutol e clavulanato, alterando frequentemente a classificação das bactérias de resistente para suscetível. A combinação com isoniazida também foi benéfica, mas as condições devem ser otimizadas, especialmente para as micobactérias de crescimento lento. Este resultado sugere que o tratamento com sub-MICs de isoniazida e etambutol interfere na biossíntese correta dos componentes do envelope celular externo, deixando o peptidoglicano mais acessível para a atividade dos β-lactâmicos. Para quantificar a exposição do peptidoglicano micobacteriano após tratamento com isoniazida ou etambutol, foram realizados ensaios de co-precipitação com recetores de Drosophila que reconhecem o peptidoglicano, proteínas de reconhecimento de peptidoglicano (PGRPs). A microscopia de fluorescência corroborou os resultados dos ensaios sinergísticos de antibióticos, mostrando que o peptidoglicano micobacteriano apenas é reconhecido pelas PGRPs após a exposição a sub-MICs de isoniazida e etambutol. Os resultados apresentados são preliminares e os ensaios estão a ser otimizados para serem realizados com isolados clínicos de Mycobacterium tuberculosis, incluindo estirpes MDR e XDR-TB, no futuro próximo. Este trabalho ajudará a estabelecer uma conexão entre mecanismos desconhecidos de resistência a antibióticos anti-TB e possíveis vulnerabilidades no envelope celular de micobactérias, que poderão ser exploradas para fins terapêuticos.