Produção, purificação e caracterização de uma lacase de Phlebia rufa (Pers.) M. P. Christ.

• Autor(a) principal: Alves, Alice Liliana
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10348/2945
• topic: Biorremediação; Fungo (Phlebia rufa); Lacase

O objectivo deste trabalho produzir, purificar e caracterizar a lacase segregada pelo fungo Phlebia rufa. Os seguintes suplementos foram adicionados ao meio basal líquido de Eggert et al. (1996) e testados: trigo, malte, ácido ferúlico e concentração adicional de sulfatos. A enzima foi produzida neste meio líquido com trigo por 24 dias. Durante a incubação a actividade da lacase foi determinada usando ácido 2,2’–azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS) como substrato e foi verificada a existência de dois picos com a actividade máxima da lacase depois de 24 dias (3,1 Uml-1). O primeiro pico obtido depois de 10 dias foi recolhido e concentrado por ultrafiltração. O extracto bruto da lacase foi purificado por cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) com um factor de purificação de 8. O rendimento obtido foi de 6%, e a actividade total de 149 U foi determinada. Depois disto a lacase foi caracterizada e encontrado que o pH óptimo depende dos diferentes substratos usados no ensaio.Com ABTS, siringaldazina (SGZ) e 2,6-dimetoxifenol (DMP) o pH óptimo determinado foi de 3,0; 5,0; e 3,5 respectivamente. A massa molecular obtida para a lacase foi de 59 kDa e a energia de activação de 19,6 kj mol-1. Com ABTS como substrato a temperatura óptima foi obtida a 65ºC. O tempo de meia vida (t1/2) da lacase determinada a 50ºC, 60ºC e 65ºC e os valores obtidos de 5 h, 11 min e 2,5 min respectivamente. A especificidade de 12 substratos foi estudada e os resultados apontam que o ácido ferúlico e o ABTS mostraram uma elevada actividade enzimática enquanto o ácido p-cumárico e o ácido protocatéquico mostraram baixa actividade (apenas 10% e 9% respectivamente, comparado com ácido ferúlico). As constantes cinéticas obtidas mostraram elevada afinidade da enzima para a SGZ (Km = 9,9 μM) seguida pelo ABTS (Km = 23,1 μM) e uma baixa afinidade para o DMP (Km = 555,4 μM). A eficiência catalítica (kcat/Km) tem a mesma ordem de grandeza (107) para o ABTS e SGZ enquanto o DMP tem baixa eficiência catalítica (105). O IC50 mostra que NaN3 é um inibidor mais potente que o NaF e NaCl com ambos os substratos (ABTS e DMP). O inibidor NaF evidenciou uma inibição não competitiva com ABTS (Kic = Kiu = 46,9 μM) e inibição competitiva (Kic = 2,6 μM) com DMP. Com ABTS a inibição mista foi obtida com azida de sódio (Kic = 5,6 μM e Kiu = 3,4 μM) no entanto com DMP, a inibição não competitiva foi encontrada (Kic = Kiu = 2,5 μM). A inibição obtida com Cl- foi competitiva para ambos os substratos, ABTS (Kic = 1407,5 μM) e DMP (Kic = 375,1 μM).