Insights on the function of MyT1L in Ascl1 mediated neuronal reprogramming

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Tomaz, Diogo Miguel Rosa
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/25009
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biomédicas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016
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spelling Insights on the function of MyT1L in Ascl1 mediated neuronal reprogrammingAscl1Neuronal ReprogrammingNotch signalling pathwayMyT1LHes1Teses de mestrado - 2016Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biomédicas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016Previous studies have accomplished direct lineage reprogramming of many cell types to different ones by using defined combinations of transcription factors. Vierbuchen et al. showed that the combined ectopic expression of Ascl1, Brn2 and MyT1L can efficiently reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) into induced neuronal (iN) cells. In another study, Ascl1 was characterized as the main driver of this process by its activity as a pioneer factor. Previous experiments with Ascl1 single-reprogramming showed that Ascl1 is capable of converting MEFs into iN cells, although the reprogrammed neurons show low levels of maturity. On the other hand, several reprogramming experiments associated MyT1L with a late function by promoting the maturation of iN cells, but not with the capacity to reprogram MEFs into iN cells like Ascl1. However, a mechanistic characterization of MyT1L still needed to be clarified. MyT1L is a member of the MYT1 family, also including MyT1 and MyT3, all zinc-finger transcription factors. Recent work from our laboratory showed that MyT1, a paralog of MyT1L, acts as a repressor of Notch targets, in neural stem/progenitor cells. One of those identified Notch targets was Hes1. In neurogenesis, the Notch pathway induces the activation of the Notch downstream effector Hes1. Hes1 functions as a repressor of proneural genes, such as Ascl1, as well as their target genes. Similar to the neurogenesis context, it is tempting to speculate that in Ascl1-dependent reprogramming Hes1 may be functioning as a repressor of Ascl1 targets in MEFs. The goal of this work is to investigate the role of MyT1L and the Notch signalling pathway in Ascl1-dependent reprogramming of MEFs into iN cells. To evaluate Notch activity in MEFs, I compared the expression levels of two Notch targets, Hes1 and Hes5, between MEFs and neural stem cells. I show that Hes1 expression in MEFs is similar to Hes1 expression in neural stem cells. Hes5 expression is substantially lower in MEFs than in neural stem cells. This suggests low Notch activity in MEFs as previous studies identify the Hes5 promoter as readout of Notch activation. Chemical inhibition of Notch signalling did not alter the Hes1 expression in MEFs. I show that the proximal promoter region of Hes1, that mediates regulation by Notch and MyT1 in neural stem/progenitor cells, is accessible to transcription factor binding in MEFs. Additionally, I show that the Notch effector transcription factor RBPJ binds to the Hes1 proximal promoter region. These results in conjunction with the high levels of Hes1 expression in MEFs suggest that the Notch pathway is not the main regulator of Hes1 expression in these cells. Work from our laboratory showed that, in transcriptional assays, MyT1 represses the Hes1 proximal promoter activity, after Notch activation. Here I show that Myt1L can counteract the Notch activation of the Hes1 promoter in a transcriptional assay. The Hes1 proximal promoter contains three consensus binding sites of the MYT1 family suggesting that MyT1L regulates the Hes1 promoter by direct DNA-binding to this region. Using chromatin immunoprecipitation assay against a tagged version of Myt1L, I show that MyT1L directly binds to the Hes1 promoter region two days after being ectopically expressed in MEFs. Finally I started the optimization of the Ascl1-depedent reprogramming protocol in MEFs. I did observe reprogrammed iN cells after single or combined expression of Ascl1 or Ascl1/MyT1L, respectively. However, the percentage of iN cells to total number of cells in culture revealed low reprogramming efficiency. Additionally, iN cells observed show low levels of maturity in single or combined expression of Ascl1 or Ascl1/MyT1L. Nonetheless, this protocol still needs further improvement. Overall, my findings indicate that MyT1L binds to DNA in MEFs at early stages of the Ascl1-dependent reprogramming protocol. The results suggest that MyT1L represses the expression of Hes1 in Ascl1-dependent reprogramming and this may lead to the activation of the Ascl1 targets that promote iN cell maturation.Vários estudos têm vindo a demonstrar que a reprogramação directa de uma linha celular somática para outros tipos celulares pode ser alcançada através da expressão ectópica de factores de transcrição. De facto, trabalho desenvolvido por Yamanaka e Takahashi (Takahashi and Yamanaka, 2006) demonstrou que a adição de quatro factores de transcrição é suficiente para reprogramar fibroblastos em células estaminais pluripotentes. Este estudo estabeleceu uma mudança de paradigma na forma como olhamos para o programa de transcrição e a plasticidade do genoma da célula. A reprogramação de um tipo celular a partir de células estaminais ou somáticas oferece um enorme potencial de aplicações na medicina regenerativa e na terapia de doenças. A reprogramação de fibroblastos em células neuronais foi alcançada através da adição de três factores de transcrição, Brn2, Ascl1 e MyT1L (BAM) (Vierbuchen et al., 2010), em que o Ascl1 é o factor de transcrição principal, uma vez que, sozinho, é capaz de converter os fibroblastos em neurónios, apesar de apresentarem baixa complexidade morfológica e capacidade funcional (Chanda et al., 2014). Curiosamente, Ascl1 funciona como um factor pioneiro, sendo capaz de se associar às regiões genómicas, independentemente de se encontrarem em locais de cromatina acessível (Raposo et al., 2015; Wapinski et al., 2013). O Ascl1 é um factor de transcrição proneural que actua como um regulador da diferenciação neuronal no cérebro de mamíferos (Bertrand et al., 2002; Wilkinson et al., 2013). No processo de neurogénese, Ascl1 actua principalmente como um activador de transcrição sobre uma grande variedade de genes que controlam vários passos da neurogénese, como a proliferação das células estaminais neurais/progenitoras, migração celular e crescimento das neurites (Borromeo et al., 2014; Castro et al., 2011, 2006). Recentemente, Ascl1 foi identificado como um factor de transcrição capaz de modificar a cromatina dos seus genes alvos, durante a neurogénese, promovendo a acessibilidade da cromatina para Ascl1 (Raposo et al., 2015). Durante a neurogénese, o Ascl1 é regulado pela via de sinalização Notch. No desenvolvimento do sistema nervoso, a via de sinalização Notch é responsável pela manutenção da população de células estaminais neuronais/progenitoras, através da inibição da diferenciação neuronal. A proteína Notch activa a expressão de genes repressores da neurogénese, dos quais se incluem os genes Hes1 e Hes5. Os genes Hes1/5 actuam como repressores da transcrição, sendo um dos seus alvos Asc1. Adicionalmente, resultados anteriores do nosso laboratório demonstraram que Hes1 inibe a expressão dos genes alvos de Ascl1. Recentemente, estudos realizados no nosso laboratório revelaram que um alvo de Ascl1 durante a neurogénese, o factor MyT1, tem um papel importante em bloquear a expressão de genes alvo de Notch, em particular o Hes1. MyT1 é um factor de transcrição da família MYT1, que é composta por outros 2 factores de transcrição: MyT1L e MyT3. Os membros desta família são altamente homólogos, particularmente nos domínios proteicos zinc-fingers, responsáveis pela ligação ao ADN (Bellefroid et al., 1996; Kim et al., 1997). Todos os membros da família MYT1 são expressos no desenvolvimento do sistema nervoso central. Em particular, MyT1L é expresso exclusivamente em neurónios e é detectado tanto na neurogénese como na fase adulta do organismo (Matsushita et al., 2014). Na reprogramação neuronal, o MyT1L tem sido utilizado em vários protocolos para promover um aumento da complexidade morfológica e das propriedades electrofisiológicas das células neuronais (Ambasudhan et al., 2011; Pang et al., 2011; Vierbuchen et al., 2010; Yoo et al., 2011). Considerando os resultados do nosso laboratório em que se demonstrou que MyT1 é um repressor da expressão de Hes1, colocámos a hipótese de que MyT1L pudesse também actuar na reprogramação de células neuronais como um repressor da expressão de Hes1. O trabalho desta dissertação teve como objectivo investigar o papel do MyT1L e da via de sinalização Notch na reprogramação de fibroblastos em células neuronais promovida por Ascl1. Em primeiro lugar analisei a actividade da via de sinalização Notch nos fibroblastos através da análise de expressão de dois genes alvos de Notch, Hes1 e Hes5. A expressão destes genes foi comparada entre fibroblastos e células NS-5, uma linha de células estaminais neurais com elevada actividade da via Notch. Os resultados demonstraram que o nível de expressão de Hes1 em fibroblastos e em células NS-5 são semelhantes. No entanto, após inibição química da actividade de Notch não observei nenhuma alteração na expressão de Hes1, o que sugere que a via sinalização Notch não é a principal reguladora de Hes1 nos fibroblastos. Contrariamente a Hes1, a expressão de Hes5 é consideravelmente inferior nos fibroblastos em relação às células NS-5. Por outro lado, a inibição química da actividade de Notch levou a uma diminuição da actividade da expressão de Hes5, indicando que Hes5 é regulado por Notch em fibroblastos. Em segundo lugar, investiguei qual o possível papel de MyT1L na regulação da expressão de Hes1 em fibroblastos. Analisei que a região promotora de Hes1, onde anteriormente o nosso laboratório demonstrou haver associação de MyT1 em células neurais/progenitoras estaminais, se encontra com cromatina acessível à associação de factores de trancrição, em fibroblastos. Também analisei a actividade de MyT1L nessa região promotora de Hes1 através de um ensaio de transcrição com a co-expressão de MyT1L e receptor Notch1 activado. Esta análise revelou que o MyT1L é um repressor do promotor de Hes1, dependente da activação pela via Notch. Esta região promotora de Hes1 contém três sítios de ligação ao ADN comum à família MYT1. De facto, os resultados da imunoprecipitação da cromatina extraída de fibroblastos revelaram uma associação do MyT1L ectopicamente expresso na região promotora de Hes1. Hes1 é um factor repressor da expressão de Ascl1 e dos seus genes alvos. De facto, é possível que, no contexto da reprogramação promovida por Ascl1, os níveis de Hes1 endógeno possam estar a reprimir a expressão dos genes alvos de Ascl1. Esta repressão de Hes1 pode explicar o baixo nível de diferenciação das células neuronais observado na reprogramação com apenas sobre-expressão de Ascl1. De facto, MyT1L foi descrito como tendo um papel importante no desenvolvimento de características de neurónios morfologicamente complexos. Assim é possível que, o MyT1L promova indirectamente a expressão dos genes alvos de Ascl1, através da inibição da expressão de Hes1. Deste modo, o protocolo de reprogramação de fibroblastos em células neuronais mediado por Ascl1 foi optimizado, com o objectivo de investigar a interacção de MyT1L e Hes1, no contexto desta reprogramação. Infelizmente, o protocolo não foi estabelecido com sucesso, devido, a uma elevada taxa de morte célular. Apesar da elevada morte celular, consegui obter células neuronais, a partir de fibroblastos, com apenas a sobre-expressão de Ascl1 em co-expressão com MyT1L. As células neuronais obtidas com estas duas condições apresentavam baixos níveis de complexidade morfológica. Em conclusão, demonstrei que MyT1L encontra-se associado à região promotora de Hes1 quando expresso de modo ectópico em fibroblastos e que Myt1L actua como um repressor da actividade da região promotora de Hes1 promovida pela activação da via de sinalização Notch. A junção destes dois resultados sugere que a inibição da expressão de Hes1 se reflicta nos fibroblastos após sobre-expressão de Myt1L. A função de MyT1L pode incluir a repressão da expressão de Hes1, promovendo a activação de genes alvos de Ascl1 responsáveis pela maturação neuronal. Experiências futuras que demonstrem uma diminuição da expressão de Hes1 após a sobre-expressão de MyT1L em fibroblastos devem ser consideradas. Adicionalmente, futuras experiências devem também focar-se na descoberta de outros genes alvo de MyT1L em fibroblastos que possam ter um papel importante na reprogramação promovida por Ascl1 de fibroblastos em neurónios.The studies presented in this thesis were carried out at the Instituto Gulbenkian Ciência (IGC) at the Molecular Neurobiology Laboratory, Oeiras. The present study was supported by Fundação Calouste Gulbenkian.Castro, DiogoSolá, SusanaRepositório da Universidade de LisboaTomaz, Diogo Miguel Rosa2016-11-09T16:35:14Z2016-01-122015-11-302016-01-12T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/25009TID:201251485enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:14:20Zoai:repositorio.ul.pt:10451/25009Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:42:04.134654Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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