Characterization of trypsin inhibition by boophilin

• Autor(a) principal: Cereija, Tatiana Barros Pereira
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10773/8874
• topic: Biologia molecular; Trombose; Sangue - Coagulação

No decurso da evolução, enquanto os vertebrados desenvolviam um complexo sistema para prevenir as perdas de sangue, os hematófagos criavam mecanismos anticoagulantes capazes de contra-atacar a reposta hemostática do hospedeiro, por forma a facilitar a extração, o armazenamento e a digestão do sangue. Muitos destes mecanismos assentam na inibição específica da trombina, proteína que tem um papel central na hemostasia. Apesar do elevado número de inibidores naturais de trombina, apenas uma pequena parte foi caracterizada bioquimicamente e, dentro desta, só alguns inibidores foram estudados de um ponto de vista estrutural. De todos aqueles com estrutura conhecida, a boofilina é o único que possui dois domínios canónicos do tipo Kunitz. No entanto, apesar de possuir domínios canónicos, a boofilina inibe a trombina através de um mecanismo não-canónico, no qual o seu N-terminal é inserido no centro catalítico da trombina enquanto que o domínio C-terminal interage com o exosite I da proteinase. Além disso, ao contrário de todos os outros inibidores caracterizados, a boofilina, em complexo com a trombina, é capaz de interagir com uma proteinase serínica adicional do tipo tripsina. Esta segunda interação envolve unicamente o domínio N-terminal, presumivelmente através do loop reactivo. In vivo, é possível que para além de inibir a trombina, a boofilina seja também capaz de inibir outra proteinase serínica da cascata de coagulação como o fXa, resultando não só na inibição da trombina mas também na diminuição da sua produção. Este aspecto faz da boofilina um bom modelo para a desenvolvimento de novos anticoagulantes terapêuticos. Pretende-se, por isso, clarificar este segundo mecanismo de inibição através do estudo da interação entre a boofilina e a tripsina. A boofilina (D1D2) e o seu domínio N-terminal isolado (D1) foram expressos em Pichia pastoris. Ambas as proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade numa coluna de tripsina seguida, no caso da D1D2, por cromatografia de troca iónica. Uma vez purificadas, a constante de inibição de cada uma das proteínas foi determinada e a D1 foi cristalizada por difusão vapor. Os cristais obtidos eram ortorrômbicos (grupo espacial P212121), tinham uma percentagem invulgarmente baixa de solvente (23%) e difrataram com uma resolução mínima de 1.80 Ǻ. A estrutura cristalográfica da D1 releva uma conformação similar à observada no complexo trombina-boofilina. O complexo tripsina-D1 foi também preparado in vitro e a sua cristalização está em curso.