Mechanical synchronization of Xenopus tail regeneration
| Autor(a) principal: | |
|---|---|
| Data de Publicação: | 2021 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/51898 |
Resumo: | Tese de Mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências |
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Mechanical synchronization of Xenopus tail regenerationRegeneraçãoSinalização mecânicaCanais mecano-sensíveisGsMTx4Xenopus laevisTeses de mestrado - 2021Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de Mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasEpimorphic regeneration is a complex and synchronous process that involves three major phenotypical phases: wound healing, regeneration bud formation and a consequent regenerative outgrowth. While regeneration occurs within a multifactorial microenvironment, where biochemical and mechanical cues are in place, most studies focus in the biochemical signalling underlying the transition across these phases. Thus, despite the wide biological functions that mechanical signals, their role in regeneration remains largely unclear. Therefore, to assess the role of relevant mechanical signals in regeneration, we use the tadpole tail of Xenopus laevis as a regeneration model. Using a specific toxin, we demonstrate that mechanosensitive stretch-activated channels are required for proper tail regeneration. In particular, we identify that these channels are essential for the wound healing and bud formation phases. Moreover, the expression of key molecular regulators of regeneration was downregulated by the same treatment. Interestingly, this downregulated expression profile is comparable to the observed in the non-regenerative refractory period. Collectively, our data unveils the role of mechanically activated channels in regeneration and opens the discussion on the potential mechanism by which mechano-signalling may mediate transcriptional responses that favour regeneration.A regeneração pode ser definida como a capacidade de recrescimento de um órgão ou membro após uma lesão ou amputação; este recrescimento devolve a forma, padrão e função da parte do corpo perdida. Esta área de estudo para além de poder ser investigada a diversos níveis de organização biológica varia também a nível taxonómico, suscitando ao longo de décadas o interesse de diversos investigadores. Nos vertebrados, podemos encontrar a regeneração epimórfica, um processo complexo e síncrono desencadeado por um dano de grande escala. Pode dizer-se que se desenvolve em três fases fenotípicas principais e distintas: a cicatrização do local da ferida, a formação do botão de regeneração, também designado por blastema, e o consequente crescimento regenerativo do membro perdido. As alterações morfológicas observadas no decorrer das três fases são o resultado de consecutivos rearranjos celulares tanto em posição, como em número e forma, entre outros. O comportamento das células é consequência dos sinais que esta recebe do seu microambiente, nomeadamente das interações com outras células circundantes e/ou com o ambiente onde se encontra. Ao longo de décadas, diversos estudos têm vindo a ser realizados com o objetivo de caracterizar os intervenientes moleculares nos mecanismos de comunicação e sinalização celular no desenrolar do processo regenerativo e particularmente nas transições morfologicas a ele inerentes. Destes estudos surgiram fatores como o Transforming growth factor beta (TGF-β), Sonic hedghog (Shh), Bone morphogenetic proteins (BMP), Fibroblast growth factor (FGF), entre outros, que se creem ser potenciais intervenientes no processo. Contudo, a verdade é que, a regeneração ocorre dentro de um microambiente multifatorial, isto é, sinais bioquímicos e mecânicos estão presentes, porém a investigação científica concentra-se maioritariamente no estudo da sinalização bioquímica subjacente às transições entre as fases do processo regenerativo. Apesar de amplas funções biológicas serem atribuídas aos sinais mecânicos, o seu papel na regeneração permanece ainda pouco evidente. Tendo isto em conta, o nosso estudo visa revelar um pouco do seu papel neste processo. Um excelente modelo animal para avaliar o papel da sinalização mecânica na regeneração é a cauda do girino de Xenopus laevis. De facto, neste modelo animal a regeneração total da cauda é observável num curto período de tempo - apenas sete dias após a amputação - e implica algum nível de complexidade biológica visto que tem de ocorrer a regeneração de todos os tecidos axiais do membro - como o tecido muscular, nervoso e da epiderme. Para além disso, o girino de Xenopus laevis é dotado de um período no seu desenvolvimento designado de refratário, durante o qual ocorre a cicatrização do local da lesão, mas não a regeneração do membro perdido. O processo regenerativo pode ser avaliado usando dois métodos: o índice de regeneração, que avalia a morfologia da cauda regenerada; e, como medida complementar, a área da cauda pós amputação. Com o presente estudo, corroborámos que a capacidade regenerativa depende do estádio de desenvolvimento do girino. Através da comparação entre o estádio 41 - regenerativo - e o estádio 47 - não regenerativo - contatámos que efetivamente, existe uma diminuição da capacidade regenerativa no período refratário. A necessidade temporal dos sinais mecânicos foi avaliada através da incubação dos girinos, nos períodos de tempo desejados - definidos pelos eventos morfológicos da regeneração - num meio com uma toxina específica - GsMTx4 - conhecida por causar a inibição dos canais sensíveis a sinais mecânicos, ativados pela extensão elástica da membrana celular - Stretch activated channels. Conseguimos demonstrar que estes são necessários para uma regeneração eficiente e bem-sucedida da cauda. Os alvos atualmente conhecidos deste péptido são os canais: Piezo1 e Transient receptor potential channel 1 e Transient receptor potential channel 6. Neste ensaio identificamos ainda que esses canais são fundamentais nas primeiras vinte e quatro horas da regeneração, mais precisamente, as fases de cicatrização da ferida e formação do blastema, conhecidas por serem cruciais para alcançar um processo bem-sucedido em forma e função. Um dos alvos de GsMTx4 reportado é o canal Piezo1. Para testar o seu eventual envolvimento no decorrer do processo de regeneração, diminuímos a sua expressão e avaliámos o fenótipo observado. Com a utilização de um morpholino específico para o canal em estudo verificamos que existe uma tendência em que os girinos submetidos ao tratamento apresentam um fenótipo caracterizado como “defeituoso”, ou seja, é prevalente o fenótipo de ausência de regeneração ou regeneração muito defeituosa. Levando em consideração estes resultados podemos especular que o canal Piezo1 é um potencial candidato a gene regulador da capacidade regenerativa. De modo a compreender melhor como o bloqueio por inibição dos canais mecânicos afeta o comportamento celular ao nível da expressão génica avaliámos por Polymerase chain reaction (PCR) a expressão dos principais contribuintes moleculares da regeneração. Com base em literatura da área foram selecionados marcadores para cada fase da regeneração - cicatrização do local da ferida, formação do botão de regeneração e crescimento do membro - respetivamente, TGF-β, Msh Homeobox 1 (Msx1) e Shh. Com a nossa análise da expressão temporal entre controlo e tratamento fomos capazes de corroborar a expressão destes marcadores como específicos para cada fase, e, para além disso, constatar que os seus níveis de transcrição foram reduzidos pelo tratamento com GsMTx4. Curiosamente, este perfil de expressão é comparável ao observado no período refratário, isto é, não regenerativo. Tendo em conta o conjunto dos dados adquirimos, podemos inferir que os marcadores avaliados neste estudo atuam a jusante dos canais mecânicos na sua cascata de sinalização. Assim sendo, no contexto do processo regenerativo, a mecanotransdução celular através destes canais, encontra-se a interferir em vias de sinalização bem estabelecidas e conhecidas nesta área de estudo. É ainda importante salientar que a análise de expressão génica serviu como pré-teste para futuramente conduzir as amostras para sequenciação do ácido ribonucleico (RNA-seq). Com certeza os resultados desta análise irão abrir o leque de potenciais intervenientes alvo no processo de regeneração. De uma maneira global, a verdade é que o impacto dos sinais mecânicos na regeneração é ainda escassamente estudado apesar de existirem evidências literárias de uma diversidade de funções biológicas desencadeadas pelos mesmos. Neste sentido, a nossa investigação tem como objetivo elucidar o seu papel e averiguar a sua necessidade ao longo do tempo. Posto isto, no presente estudo, fomos capazes, por meio da inibição dos canais previamente mencionados, de manipular como as células detetam e consequentemente respondem aos sinais mecânicos. Demonstrámos, de facto, a importância da mecanotransdução na área da regeneração e a sua necessidade ao longo do tempo. Mais concretamente, a ativação dos canais sensíveis a estímulos mecânicos ativados pela extensão elástica da membrana celular é essencial para a fase inicial do processo de regeneração, que engloba as fases de cicatrização de ferida e a formação do blastema. Em suma, a regeneração e o desenvolvimento embrionário, partilham as principais vias de sinalização celular e os principais mecanismos comuns, deste modo, os canais sensíveis a sinais mecânicos podem estar envolvidos em diferentes circunstâncias para além da regeneração de tal modo que as evidências demonstradas neste estudo podem ser transversais. Com a nossa investigação abrimos a discussão sobre o potencial mecanismo pelo qual a sinalização através de sinais mecânicos pode mediar as respostas transcricionais que favorecem a regeneração, e ainda despoleta a curiosidade e novas investigações na ampla área que é a biologia do desenvolvimento.Barriga, Elias H.Sucena, José Élio da SilvaRepositório da Universidade de LisboaFerreira, Inês de Almeida2022-03-22T16:20:30Z202120212021-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/51898TID:202994449enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:56:55Zoai:repositorio.ul.pt:10451/51898Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:03:07.263180Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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