Disposable immunosensor for diagnosis of human cytomegalovirus congenital infection

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Pires, Filipa Andreia Velez
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.6/3235
Resumo: Human cytomegalovirus is a herpes virus which can cause pneumonia, retinitis, colitis and encephalopathies in immunosuppress individuals, as transplanted ones, persons infected by HIV, and individuals with immature immune system, like fetuses and newborns. In the last ones microcephaly, small body size, hepatomegaly, blindness, deafness and mental retardation can also be observed. This infection is the most frequent cause of embryogenic and fetal pathology induced by a virus. In the actuality, the diagnosis of HCMV is based on clinical and immunologic data. There are several methods for HCMV detection: the virus isolation in fibroblasts culture, the shell-vial method, the PCR technique, the ELISA test and the western blotting technique. However all of them require a long period of time to perform or are costly which is problematic for diagnosis. Therefore, an immunosensor was developed for human cytomegalovirus glycoprotein B detection based on electrochemical stripping analysis of silver nanoparticles. In this sandwich type immunosensor, the silver deposition solution is added to the electrode surface where the gold nanoparticles attached to antibodies, will catalyze the reduction reaction of silver ions, leading to the formation of silver nanoparticles. The higher concentration of analytes means that more amounts of gold nanoparticles are capture on the sensor surface, producing more silver nanoparticles. The silver nanoparticles are dissolved and measured by anodic stripping voltammetry. This method allows a faster and, we expect, a more sensitive way to detect HCMV.
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spelling Disposable immunosensor for diagnosis of human cytomegalovirus congenital infectionCitomegalovírus humano - Infecção congénitaImunosensoresElectrodos serigrafadosGlicoproteína BHuman cytomegalovirus is a herpes virus which can cause pneumonia, retinitis, colitis and encephalopathies in immunosuppress individuals, as transplanted ones, persons infected by HIV, and individuals with immature immune system, like fetuses and newborns. In the last ones microcephaly, small body size, hepatomegaly, blindness, deafness and mental retardation can also be observed. This infection is the most frequent cause of embryogenic and fetal pathology induced by a virus. In the actuality, the diagnosis of HCMV is based on clinical and immunologic data. There are several methods for HCMV detection: the virus isolation in fibroblasts culture, the shell-vial method, the PCR technique, the ELISA test and the western blotting technique. However all of them require a long period of time to perform or are costly which is problematic for diagnosis. Therefore, an immunosensor was developed for human cytomegalovirus glycoprotein B detection based on electrochemical stripping analysis of silver nanoparticles. In this sandwich type immunosensor, the silver deposition solution is added to the electrode surface where the gold nanoparticles attached to antibodies, will catalyze the reduction reaction of silver ions, leading to the formation of silver nanoparticles. The higher concentration of analytes means that more amounts of gold nanoparticles are capture on the sensor surface, producing more silver nanoparticles. The silver nanoparticles are dissolved and measured by anodic stripping voltammetry. This method allows a faster and, we expect, a more sensitive way to detect HCMV.O Citomegalovírus humano é um vírus que pode causar pneumonia, renite, colite e encefalopatias em indivíduos immunosuprimidos, como sujeitos transplantados, infectadas com o vírus VIH e com sistema imune imaturo, como fetos e recém-nascidos. Nestes últimos, pode-se observar microcefalia, pequeno tamanho corporal, hepatomegalia, cegueira, surdez e atraso mental. Esta infecção é a causa mais frequente de patologias embriogénicas e fetais induzidas por um vírus. Na infeção aguda por HCMV são gerados anticorpos específicos para um grande número de proteínas estruturais e não estruturais. Embora o vírus codifique mais de 100 proteínas apenas as glicoproteínas B e H induzem anticorpos capazes de neutralizar o vírus e eliminar células infetadas (anticorpos neutralizantes). A glicoproteína B (gB) é o antígeno dominante existente na cápsula de HCMV e aproximadamente 100% dos indivíduos infetados com HCMV desenvolvem anticorpos contra esta proteína. Na glicoproteína B foram identificados três sítios de ligação ao anticorpo: domínio antigénico 1 (AD-1),2 (AD-2) e 3 (AD-3). O domínio AD-2 compreende dois locais, local I (resíduos 68-77) e local II (resíduos 50-54). Dos três domínios, apenas o domínio AD-1 e o local II do domínio AD-2 são capazes de induzir anticorpos neutralizantes do vírus durante a infecção natural. O domínio AD-1 representa o local imunodominante da gB. Na verdade, cerca de 100% dos indivíduos infectados que são seropositivos para gB têm anticorpos contra o domínio AD-1 enquanto o domínio AD-2 é apenas reconhecido por 47%. AD-1 é um domínio estrutural muito complexo, que tem entre 552-635 resíduos de gB. A ligação de anticorpos requer a presença da sequência completa de AD-1 e a formação de uma ligação disulfureto intramolecular entre a cisteína 573 e cisteína 610. Supõe-se que a ligação dos anticorpos a AD-1 não é afectada por glicosilação da gB, uma vez que os anticorpos também reconhecem a proteína não glicosilada. Além disto, enquanto outros domínios da molécula mostram uma variação significativa entre os isolados, o domínio AD-1 parece ser das regiões da gB mais altamente conservada. Assim, o domínio de AD-1 pode ser visto como uma fração promissora a ser usada em testes de diagnóstico para verificar a presença de anticorpos neutralizantes e pode ser utilizado para estabelecer uma relação entre a presença destes anticorpos e a ocorrência de sintomas. Atualmente, o diagnóstico de citomegalovírus humano (HCMV) é baseado em informações clínicas e imunológicas. Existem vários métodos para a deteção de HCMV. O isolamento do vírus em cultura de fibroblastos é o método convencional. Neste, é feito o isolamento do vírus a partir de um tecido de biopsia ou de um fluido corporal, tal como a urina. Após isolamento, o HCMV é replicado “in vitro”, incubado com fibroblastos a 36 °C durante uma a três semanas e posteriormente a incubação é analisada com o objetivo de identificar inclusões de HCMV em fibroblastos. Este método, que requer assepsia total, não é utilizado pois requer um longo período de tempo para sua execução, dificultando assim o diagnóstico. O método “Shell-vial” é muito similar ao anterior, mas o tempo de revelação (feito por imunofluorescência indireta) diminui para 24, 48 ou 72 horas, devido à utilização de anticorpos monoclonais contra diferentes antigénios de HCMV e à utilização de centrifugação que facilita o processo da penetração do vírus em fibroblastos. Outro método alternativo para análise de amostras clínicas é o PCR (Polimerase Chain Reaction). É uma técnica rápida (~ 6h) que apresenta uma elevada sensibilidade, baseada na amplificação seletiva de sequências específicas de ácidos nucleicos, permitindo a detecção de ADN viral. A sensibilidade e especificidade deste método é semelhante ao método de isolamento viral, mas o PCR apresenta algumas vantagens, tais como a velocidade de obtenção do resultado e a possibilidade de uso de amostras congeladas. Esta técnica é bastante utilizada apesar do seu custo elevado e dificuldade de realização. Pode ser utilizada tanto qualitativamente (diagnóstico por PCR) como quantitativamente através da medição da carga viral, que é proporcional ao nível de ADN de HCMV. Outra técnica é a de ELISA (Enzime-Linked Immunosorbent Assay), esta apresenta uma sensibilidade de 100% e uma especificidade de 86% na deteção de anticorpos no sangue. No entanto, existe a possibilidade de resultados falso-positivos, causados por reações cruzadas com algum vírus da família Herpesviridae, fator reumatóide e anticorpos antinucleares. Finalmente, outro método que pode ser usado para a deteção é o “Western Blotting”, que permite a medida da afinidade do anticorpo para o antigénio. No entanto, este método também apresenta uma disponibilidade comercial questionável, porque igualmente alguns resultados falso-positivos podem ser observados. Como descrito, todas estas técnicas de ensaio envolvem, por vezes, ou equipamentos caros e/ou procedimentos igualmente caros, demorados, complicados e conducentes a falsopositivos. As células eletroquímicas são de grande interesse na análise de substâncias devido à sua robustez, fabrico fácil e económico. Uma das técnicas mais utilizadas no fabrico dos elétrodos que se utilizam nas células eletroquímicas é a serigrafia. Esta técnica permite construir sensores químicos com uma alta reprodutibilidade e uma infraestrutura mínima. A serigrafia é um método de impressão direta, também denominado de impressão por penetração. A deposição de tintas é realizada por camadas sobre um substrato. A qualidade dos sensores químicos assim fabricados depende, em grande medida, dos materiais utilizados. Mediante a tecnologia de elétrodos serigrafados, é possível a miniaturização dos sensores, que oferecem a vantagem de terem baixo custo, serem versáteis, poderem ser fabricados com configurações de elétrodo distintas e com diferentes tintas. Devido às suas características, esta tecnologia ajusta-se bem à produção em massa de elétrodos descartáveis. Para aumentar a seletividade dos elétrodos, estes são modificados por diferentes métodos, por exemplo imobilizando uma substância na sua superfície. O método de imobilização é muito importante pois influencia o tempo de vida do sensor e a sua sensibilidade. Existem diferentes tipos de imobilização, designadamente: adsorção, aprisionamento, reticulação e ligação covalente. O dispositivo desenvolvido neste trabalho, através da sua simplicidade, baixo custo e tempo de análise relativamente curto, tem como objectivo superar todas as desvantagens referidas anteriormente para as técnicas de diagnóstico normalmente utilizadas, pois combina as vantagens dos dispositivos electródicos com o uso de anticorpos específicos para a detecção de glicoproteína B. Neste trabalho, desenvolveu-se um immunosensor do tipo sandwich. Neste é adicionada uma solução de deposição de prata à superfície onde, os anticorpos marcados com nanopartículas de ouro irão catalisar a reacção de redução dos iões de prata, levando a formação de nanopartículas de prata. Uma maior concentração de analito significa que uma maior quantidade de nanopartículas de ouro serão capturadas na superfície do eléctrodo que, por sua vez, irão levar à produção de mais nanopartículas de prata. As nanopartículas de prata são depois dissolvidas e medidas por voltametria de redissolução anódica. Este método permite uma forma mais rápida, económica e sensível para a detecção de glicoproteína B.Cabral, Ana Cristina Mendes DiasArcos Martínez, Maria JúliauBibliorumPires, Filipa Andreia Velez2015-04-13T10:14:56Z2013-0620132013-06-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.6/3235enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-12-15T09:39:34Zoai:ubibliorum.ubi.pt:10400.6/3235Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T00:44:42.860141Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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