Molecular diagnosis of familial hypercholesterolemia and functional characterization of missense variants in the LDLR gene

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Valentim de Azevedo, Sílvia
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.18/3519
Resumo: Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentado à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2015. Defendida e aprovada em 26 de novembro de 2015.
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spelling Molecular diagnosis of familial hypercholesterolemia and functional characterization of missense variants in the LDLR geneHipercolesterolemia FamiliarLDLRDiagnóstico MolecularVariantesEstudos FuncionaisDoenças Cardio e Cérebro-vascularesPortugalFamilial hypercholesterolemiaMolecular DiagnosisVariantsFunctional StudiesDissertação de Mestrado em Bioquímica apresentado à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2015. Defendida e aprovada em 26 de novembro de 2015.Trabalho de investigação realizado no Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças Não Transmissíveis do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, Grupo de Investigação Cardiovascular (Julho 2014 – Julho 2015).Mafalda Bourbon: Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças não Transmissíveis, do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge.[PT] A Hipercholesterolemia Familiar (FH) é uma patologia genética que é transmitida de forma autossómica dominante e é caracterizada por elevados níveis de colesterol no plasma desde o nascimento. A FH ocorre devido a variantes funcionais num dos genes codificantes de três proteínas: recetor de lipoproteínas de baixa densidade (LDLR), apolipoproteína B-100 (APOB) ou pró-proteína convertase subtilisina quexina tipo 9 (PCSK9). O LDLR é uma glicoproteína membranar que liga e internaliza colesterol associado às lipoproteínas de baixa densidade (LDL), que constituem o principal transportador de colesterol no sangue. Variantes no gene LDLR podem resultar num catabolismo deficiente das LDL, tendo como consequência o aumento do colesterol no plasma, que se acumula nos tendões e artérias. Esta acumulação pode levar ao desenvolvimento prematuro de aterosclerose e doença cardiovascular. A FH apresenta duas formas clínicas: a forma heterozigótica, que apresenta um fenótipo menos agressivo, com valores de colesterol total entre 290 e 500 mg/dl (com LDL>190 mg/dl); e a forma homozigótica, que apresenta um fenótipo mais agressivo, com valores de colesterol total entre 600 mg/dl e 1000 mg/dl. Estima-se que as prevalências das formas heterozigótica e homozigótica sejam de 1/500 e de 1/1000000 indivíduos, respetivamente. Sabe-se ainda que mais de 90% dos casos identificados apresentam uma variante no LDLR, fazendo deste gene o mais associado a esta doença. Apesar de haver mais de 1600 variantes do LDLR reportadas em bases de dados, para a maior parte delas não existe registo de estudos funcionais que provem a sua patogenicidade, levando a que não seja possível atribuir um diagnóstico molecular definitivo a estes casos. Assim sendo, a necessidade de avaliar funcionalmente estas variantes, de modo a perceber em que medida afetam a função do recetor, também se torna imperativa. Tendo em conta as prevalências acima referidas, estima-se que em Portugal existam cerca de 20000 casos de FH. O Estudo Português de Hipercolesterolemia Familiar (EPHF), implementado em 1999 no Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, tem como objectivo a determinação da prevalência e distribuição desta patologia em Portugal. A população em estudo é constituída por indivíduos de ambos os sexos e todas as idades, desde que cumpram com os critérios para o diagnóstico clínico de FH. O diagnóstico clínico de FH é feito, em Portugal, de acordo com os critérios clínicos adaptados de “Simon Broome Heart Research Trust” e idealmente deverá ser realizado o estudo genético, com a identificação da variante, pois só desta forma é possível confirmar o diagnóstico clínico. A realização de estudos funcionais para determinar o efeito de variantes identificadas na função da proteína é também de elevada importância, podendo contribuir para uma terapêutica mais personalizada. O EPHF está dividido em duas partes: o estudo bioquímico e o estudo molecular. Este último está sub-dividido em cinco fases. A fase I compreende a extração de DNA, o estudo do promotor, todos os exões e regiões adjacentes do LDLR, bem como das variantes mais comuns nos exões 26 e 29 da APOB. A fase II consiste no estudo de grandes rearranjos por Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). A fase III consiste no estudo do PCSK9 e a fase IV no estudo de todo o gene da APOB. A V e última fase consiste na realização de estudos funcionais in vitro para variantes cuja patogenicidade ainda é desconhecida. Assim sendo, este projeto está dividido em duas partes, que compreendem três das cinco fases do EPHF, nomeadamente as fases I, II e V. A primeira parte consistiu na realização do estudo molecular em participantes do EPHF, estudando o promotor e os 18 exões e regiões adjacentes do LDLR, bem como o estudo de parte dos exões 26 e 29 da APOB por Polymerase Chain Reaction (PCR) e sequenciação de Sanger. De seguida, procedeu-se à pesquisa de grandes rearranjos por MLPA. Uma predição, utilizando as ferramentas in silico, foi também realizada, de modo a prever o impacto das alterações encontradas ao nível da proteína. Esta predição foi realizada tanto para alterações identificadas ao nível do exão, com as ferramentas Polymorphism Phenotyping (PolyPhen-2), Sorting Tolerant From Intolerant (SIFT) e Mutationtaster, como para as alterações identificadas ao nível do intrão, de modo a prever efeitos no splicing, com as ferramentas Human Splicing Finder (HSF), the Splice Site Prediction by Neutral Network (NNSSP) e FSPLICE. A segunda parte deste projeto consistiu então no estudo funcional das 10 variantes do LDLR mais comuns na população portuguesa, até à data sem estudos funcionais. As diferentes variantes do LDLR foram obtidas por mutagénese dirigida num plasmídeo pcDNA3_LDLR sob o controlo do promotor viral SV40. Toda a região de interesse foi confirmada por sequenciação de Sanger e foi feita uma reclonagem, em que o gene LDLR, já com a variante, foi transferido para um vetor limpo. Células CHO-ldlA7, que não expressam endogenamente o recetor, foram transfetadas com os diferentes plasmídeos. A expressão do recetor foi avaliada através da deteção com anticorpos; a ligação e a internalização foram avaliados através do uso de LDL fluorescentemente marcada com FITC. O impacto de todas as variantes ao nível da expressão, ligação e internalização foi analisado por citometria de fluxo. Em 25 casos índex estudados, 11 variantes foram identificadas em 12 doentes, embora duas destas sejam provavelmente benignas. A variante patogénica mais frequentemente encontrada na APOB foi identificada em apenas 2 doentes. De entre as alterações encontradas no LDLR (10), 2 foram aqui primeiramente reportadas e 8 já tinham sido anteriormente identificadas. De entre estas últimas, 7 já apresentavam estudos funcionais comprovando a sua patogenicidade. Aquando da pesquisa por grandes rearranjos nestes doentes por MLPA, nenhuma alteração deste tipo foi identificada no grupo em estudo. O estudo funcional das dez alterações mais frequentemente identificadas no decorrer do EPHF, até à data sem estudos funcionais que comprovem o impacto na função do recetor, revelou que, de entre as 10 variantes estudadas, 7 são patogénicas, afetando de alguma forma a função do LDLR. A variante c.1802A>T p.(Asp601Val) é patogénica, fazedo com que não haja sequer LDLR à superfície celular. Como não atinge a membrana (por não ser expressa ou por não se ancorar a esta) apresenta valores de ligação e de internalização igualmente baixos. As variantes c.1876G>A p.(Glu626Lys), c.631C>G p.(His211Asp), c.661G>T p.(Asp221Tyr), c.618_638del p.(Gly207_Ser213del) e c.551G>A p.(Cys184Tyr) apresentaram uma expressão normal. No entanto, foram observáveis valores muito reduzidos para a fluorescência associada à união das LDL nestes casos. Consequentemente, a internalização também é defetiva, parecendo lógico classificar estas variantes como patogénicas. A variante c.1775G>A p.(Gly592Glu) resulta num defeito, possivelmente, ao nível da reciclagem do recetor, sendo também considerada patogénica. Por outro lado, as variantes c.1816G>T p.(Ala606Ser), c.1966C>A p.(His656Asn) e c.2177C>T p.(Thr726Ile) parecem não revelar qualquer impacto no LDLR, sugerindo a sua neutralidade, pois obtiveram-se valores de fluorescência, associados à expressão e atividades de ligação e internalização, comparáveis ao wt. Estes resultados sugerem que os doentes portadores destas variantes devem apresentar outra justificação para o seu fenótipo hipercolesterolémico. A análise destas variantes através de ferramentas de predição in silico, realizada para todas as variantes identificadas no decorrer deste projeto, permitiu concluir que estas predições nem sempre vão de encontro ao determinado através da realização de estudos funcionais. Assim sendo, estes programas deverão ser usados, mas com a devida ressalva de que são apenas preditores. A FH é uma doença para a qual, felizmente, existe um diagnóstico definitivo (genético) e variados tratamentos farmacológicos. Apesar de ser uma doença subdiagnosticada, estão a ser realizadas diversas iniciativas para que haja uma maior divulgação da doença, nomeadamente dos benefícios do diagnóstico precoce. No âmbito da EPHF tem-se feito um esforço para que seja implementado o diagnóstico molecular como diagnóstico preferencial, juntamente com a execução de estudos funcionais para determinar a patogenicidade de variantes desconhecidas. Só assim os doentes têm a possibilidade de ter um diagnóstico definitivo para a sua patologia tornado possível instituir medidas preventivas com uma terapêutica dirigida e personalizada, melhorando o prognóstico destes doentes.[EN] Familial Hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disorder characterized by increased levels of plasmatic cholesterol since birth. FH occurs due to functional variants in one of three genes: low density lipoprotein receptor (LDLR), apolipoprotein B-100 (APOB) and proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9). This disorder has an estimated prevalence of 1:500 individuals, being more than 90% of FH patients identified with a variant in the LDLR gene. The LDLR is a membrane glycoprotein, responsible for binding and uptake of low density lipoproteins (LDL), the major cholesterol transporter in blood. Variants in LDLR gene may result in a defective LDL catabolism, leading to increased cholesterol levels in plasma, accumulating in tendons and arteries. Cholesterol accumulation in untreated FH patients leads to premature atherosclerosis and cardiovascular disease development. Although more than 1600 variants identified in this gene are reported in databases, the majority of them remains, until now, without functional studies proving their pathogenicity. For patients carrying these variants, a definitive molecular diagnosis for FH is not possible. The main purpose of Portuguese Study of Familial Hypercholesterolemia (EPHF) is to perform the molecular diagnosis of patients who were clinically diagnosed. Criteria used are adapted from the ones of Simon Broome. Furthermore, the performance of functional studies for variants of unknown pathogenicity is imperative, in order to better clarify the molecular basis of this disorder. During this project, the molecular diagnosis was performed for 25 index cases, participants of Portuguese FH Study. Among all of them, 11 variants were identified in 12 patients. Among these, 2 were novel, being first described in this project. The remaining 9 have been previously reported, although only 7 have been functionally assessed. The search for large rearrangements was performed by Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA), but no alteration of this type was identified. The 10 most common LDLR variants described during the Portuguese FH Study, to date without functional assessment, were selected. In silico assessment was performed using described tools, in order to predict their pathogenicity. Site-directed mutagenesis was successfully performed in a pcDNA3_LDLR plasmid for all variants, being expressed in CHO–ldlA7 cells, lacking endogenous expression of LDLR. LDLR expression, binding and uptake were independently assessed by flow cytometry. Results suggest that among 10 functionally studied variants, 7 cause an impairment in LDLR function. Variants c.1802A>T p.(Asp601Val), c.1876G>A p.(Glu626Lys), c.631C>G p.(His211Asp), c.661G>T p.(Asp221Tyr), c.618_638del p.(Gly207_Ser213del), c.551G>A iv p.(Cys184Tyr) and c.1775G>A p.(Gly592Glu) were classified as pathogenic. However, variants c.1816G>T p.(Ala606Ser), c.1966C>A p.(His656Asn) e c.2177C>T p.(Thr726Ile) seem to be neutral, not revealing any kind of impact on the LDLR function. Comparing functional studies with in silico tools predictions led to the conclusion that these are useful, but should not be the only source of evidence for a diagnosis associated to a pathology. FH is a disease for which, fortunately, a genetic diagnosis and therapeutic options exist. Although it remains as a subdiagnosed disorder, the performance of a molecular diagnosis, along with functional assessment of variants with unknown pathogenicity, allows a definite diagnosis. This way, preventive measures and personalized counseling can be made in order to improve FH patients’ prognostic, providing them longer and better lives.Bourbon, MafaldaRepositório Científico do Instituto Nacional de SaúdeValentim de Azevedo, Sílvia2017-11-30T01:30:11Z2015-11-262015-11-26T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.18/3519enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-20T15:39:55Zoai:repositorio.insa.pt:10400.18/3519Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T18:38:31.632669Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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