In vitro and in vivo evaluation of new hybrid molecules following its incorporation into a lipid-based nanosystem for melanoma management

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Penetra, Maria João Maia
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/54535
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia
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spelling In vitro and in vivo evaluation of new hybrid molecules following its incorporation into a lipid-based nanosystem for melanoma managementMelanomaHybrid moleculesIn vitro screening liposomesMurine melanoma modelTeses de mestrado - 2021Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de FarmáciaO melanoma é um tipo de cancro muito agressivo, cuja incidência continua a aumentar, particularmente na Europa. Para além disso, conta também com um elevado número de mortes associadas, em particular no melanoma metastático. De entre as várias terapêuticas existentes para o seu tratamento, a cirurgia é a primeira opção para os estadios primários, revelando-se curativa. No entanto, em estadios mais avançados outras terapias são necessárias para uma boa gestão da doença, nomeadamente a terapêutica alvo, a imunoterapia e a quimioterapia. Todas estas terapias convencionais apresentam, no entanto, desvantagens, especialmente no melanoma metastático. Para além de algumas destas estratégias terapêuticas serem pouco seletivas para as células cancerígenas, estando na origem de efeitos secundários graves, os pacientes acabam também por desenvolver resistência aos tratamentos. Sendo o melanoma uma doença tão complexa, o recurso a terapias combinadas, está associado a uma maior eficácia terapêutica. No entanto, existe também o risco de interações medicamentosas e fármacos em concentrações sub-terapêuticas. Assim surgiu o conceito de moléculas híbridas, que por combinarem dois ou mais farmacóforos, possuem mais do que uma ação terapêutica, numa única molécula, superando, deste modo, algumas das dificuldades associadas ao uso de terapias combinadas. Neste sentido, diversas moléculas híbridas com atividade anti-melanoma foram desenvolvidas. Uma classe destes compostos, são os derivados do triazeno 4-mercaptofenol (TMD), os quais possuem ação dupla, conferida pela conjugação de dois diferentes tipos de farmacóforos, um análogo da tirosina, capaz de ser ativado pela tirosinase, a enzima que se encontra sobre-expressa nas células do melanoma, e derivados do triazeno, um agente alquilante de DNA. As células cancerígenas na presença destes compostos, através da oxidação do grupo fenol pela tirosinase, permitem a quebra da molécula e a libertação do grupo triazeno, que irá atuar ao nível do DNA celular. Por outro lado, na transposição destas moléculas para estudos in vivo, verifica-se muitas vezes que as mesmas apresentam eficácia terapêutica reduzida. Este efeito pode estar relacionado com várias características das moléculas, nomeadamente, baixa solubilidade, perfil de biodistribuição inadequado, degradação química antes do composto atingir as células alvo, e a interação com tecidos saudáveis, que está na origem de efeitos tóxicos. Com vista a ultrapassar todas estas dificuldades, a associação destas moléculas a sistemas de veiculação de fármacos, como os lipossomas, constitui uma alternativa promissora. Os lipossomas são constituídos por fosfolípidos, que na presença de água, formam vesículas, capazes de incorporar moléculas hidrofilicas, hidrófobas e anfipáticas. Para além de serem biocompatíveis, não tóxicos e não imunogénicos, os lipossomas conseguem melhorar o tempo em circulação dos compostos incorporados, prevenir interações não desejadas, reduzir a degradação enzimática dos compostos, promover um direcionamento para locais alvo, aumentando a concentração dos compostos nos tecidos ou órgãos afetados. Neste trabalho diversas moléculas TMD foram testadas, com vista a que uma delas, a mais promissora e com mais capacidades anti tumorais, fosse escolhida para ser testada num modelo murino de melanoma. Assim, após um screening in vitro das moléculas, diversos ensaios foram realizados, nomeadamente: distribuição do ciclo celular, Guava ViaCount, atividade das caspases 3/7 e a atividade hemolítica, em linhas celulares de melanoma, humanas e murinas. Os resultados obtidos foram satisfatórios, demonstrando que duas das moléculas, CTA10 e SM01, após os testes de screening, promoveram uma diminuição da viabilidade celular de células murinas de melanoma, impediram a progressão do ciclo celular para além das fase G0/G1, com uma diminuição simultaneamente das populações celulares na fase S do ciclo. Por outro lado, o ensaio das caspases apoptóticas 3/7, revelou que ambos os compostos, em concentrações sub-tóxicas, resultaram num aumento da atividade desta enzima relativamente ao controlo negativo e ao controlo positivo, células tratadas com dacarbazina (DTIC), um fármaco aprovado para o tratamento do melanoma. Com estes resultados satisfatórios, ambas as moléculas foram incorporadas em lipossomas que incluíram na sua composição PEG, conferindo assim propriedades de longo tempo de circulação na corrente sanguínea e potenciando, deste modo, a extravasão e acumulação nos locais tumorais. Os lipossomas foram preparados pelo método Desidratação-Re-hidratação, seguido de um passo de extrusão para reduzir e homogeneizar o tamanho médio dos lipossomas. As formulações lipídicas foram extensivamente caracterizadas, apresentando um diâmetro médio de 150 nm, uma superficial neutra, e eficiências de incorporação na ordem dos 90%. Testes de estabilidade em suspensão, a 4 ºC, das duas formulações foram também realizados. Estes revelaram que, 7 dias após a preparação das nanoformulações, mais de 65% das moléculas TMD incorporadas continuavam associadas aos lipossomas. Com base nos resultados in vitro, o composto mais promissor, que se foi destacando ao longos dos diferentes ensaios, foi escolhido para ser avaliado in vivo. O composto selecionado, na forma livre e lipossomal, foi testado em termos de atividade hemolítica, após incubação com eritrócitos de dadores saudáveis. As formulações não apresentaram atividade hemolítica (% de hemólise < 3%). A formulação escolhida foi seguidamente testada in vivo, em termos de segurança e atividade anti tumoral. Os testes in vivo de segurança foram realizados em murganhos C57BL/6 saudáveis, que foram durante 5 dias, injetados com o composto escolhido, na forma livre e lipossomal. Através da análise dos índices tecidulares e níveis das enzimas hepáticas, não foram observados efeitos tóxicos, demonstrando assim a segurança das formulações testadas. A avaliação da atividade anti tumoral, foi realizada num modelo murino de melanoma, através da administração subcutânea de células murinas B16F10. tumoral com uma injeção. Após as massas tumorais se tornarem palpáveis, o tratamento teve início e durante 7 dias os animais foram divididos em quatro grupos: grupo controlo, animais induzidos e não tratados, tratados com DTIC, ou com o composto na formas livre lipossomal. A progressão do tumor foi avaliada através da variação do volume da massa tumoral. Os animais tratados com a formulação lipossomal apresentaram uma progressão da massa tumoral mais baixa comparativamente a todos os outros grupos testados ao longo do esquema de tratamento. Para além disso, este grupo de animais apresentou também um valor médio das respetivas massas tumoral mais baixos, no final do tratamento. Com base nos índices tecidulares não foram verificadas diferenças entre os grupos em estudo. Para além disso, os níveis das enzimas hepáticas também não mostraram qualquer diferença entre os grupos experimentais e o controlo. De uma forma geral, a molécula TMD escolhida, para além de ser seletiva para a tirosinase, uma vez que um dos seus farmacóforos é um análogo do substrato desta enzima, e o outro apresenta propriedades citotóxicas, capazes de afetar o DNA celular. Os ensaios in vitro demonstraram a sua capacidade de reduzir a viabilidade celular de células tumorais, impedir a progressão do ciclo celular e aumentar a atividade de enzimas apoptóticas. Foi também demonstrada a segurança in vivo do composto para administração intravenosa. Para além disto, nos testes de eficácia terapêutica, num modelo murino de melanoma, a progressão das massas tumorais foi inferior comparativamente ao fármaco utilizado em clínica, o DTIC.Melanoma is a very aggressive type of cancer, being chemotherapy the most used strategy to fight it, despite its lack of selectivity and severe side effects. Hereupon, the main goal was to test, new synthesized hybrid molecules, triazene 4-mercaptophenol derivatives (TMD), that possess a dual action provided by two pharmacophores, a substrate for tyrosinase, the enzyme overexpressed in melanoma cells, and a triazene derivative, an alkylating agent. Following an in vitro screening in human and murine melanoma cell lines, for the TMD compounds that displayed higher antiproliferative properties, cell cycle distribution, Guava ViaCount assay, caspases 3/7 activity and hemolytic activity were also evaluated. For the most promising molecule and aiming to improve its in vivo fate, reduce systemic toxicities, by avoiding healthy organs while enhancing the accumulation at melanoma tumor sites, its incorporation long blood circulating liposomes using a dehydration-rehydration method followed by an extrusion step to reduce and homogenize their mean size was performed. Liposomal formulations were extensively characterized, presenting a mean size of around 150 nm, a neutral surface charge, an incorporation efficiency of around 90%, and suspension stability higher than 65% one week after preparation in suspension at 4ºC. The so optimized TMD liposomal formulation was tested in vivo, in terms of safety and antitumor effect. The latter was evaluated in a syngeneic C57BL/6 melanoma murine model, after a subcutaneous injection of B16F10 cell line. The progression of the tumor was assessed for animals treated with TMD in free and liposomal forms and compared with induced and non-treated mice (negative control) or mice treated with dacarbazine (positive control), a drug in clinical use for the treatment of melanoma. TMD in the liposomal form displayed the highest antitumor effect as revealed by the RTV and the lowest average mass tumor at the end of the experimental protocol. No toxic side effects were observed for mice treated with TMD formulations based on tissue index in vital organs or hepatic enzyme levels.Com o patrocínio do iMed - Research Institute for Medicines, Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa.Gaspar, Maria ManuelaAmaral, Joana São José DiasRepositório da Universidade de LisboaPenetra, Maria João Maia2021-12-212021-11-262024-12-21T00:00:00Z2021-12-21T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/54535TID:203014871enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:00:59Zoai:repositorio.ul.pt:10451/54535Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:05:21.558385Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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