New reporters for antibiotic discovery
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|---|---|
| Data de Publicação: | 2018 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/36166 |
Resumo: | Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018 |
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New reporters for antibiotic discoveryStaphylococcus aureusMultirresistência a antibióticosPotencial de membranaBiossíntese de ácidos gordosHomeostasia da membrana celularTeses de mestrado - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018Staphylococcus aureus é uma bactéria patogénica nosocomial, versátil e com grande capacidade de adaptação a diversos ambientes. A penicilina constituiu a primeira linha de tratamento eficaz contra graves infeções causadas por esta bactéria. No entanto, a evolução da mesma levou ao aparecimento e posterior disseminação de estirpes produtoras de penicilinases. De forma a contornar este problema inicial de resistência antimicrobiana, foram desenvolvidos compostos sintéticos derivados da penicilina, nomeadamente, meticilina e oxacilina. Estes compostos passaram a ser utilizados como terapia antimicrobiana contra infeções de estirpes resistentes à penicilina. O uso clínico destes antibióticos conduziu à emergência de estirpes resistentes à meticilina (methicillin-resistant Staphylococcus aureus - MRSA) e subsequente evolução da sua resistência a todos os antibióticos disponíveis. Posteriormente, ocorreu a disseminação da multirresistência de algumas destas estirpes até à situação atual, o que levou a um aumento, à escala mundial, da mortalidade associada a infeções causadas por S. aureus, mesmo em indivíduos considerados saudáveis (sem outras patologias associadas). Dado que esta bactéria patogénica surge em formas resistentes a vários antibióticos, aos quais era previamente suscetível, o número de opções de tratamento ao qual se pode recorrer é reduzido, sendo na maioria dos casos utilizada vancomicina, ou alternativamente daptomicina e linezolida. Contudo, já existem casos e estudos de estirpes de S. aureus resistentes a estes compostos. Embora em Portugal a prevalência de MRSA esteja aparentemente a diminuir, estas estirpes continuam a ser um problema bastante grave, correspondendo a cerca de 50% das estirpes isoladas, o que constitui um dos números mais elevados a nível europeu. Deste modo, a investigação de novas estratégias que permitam o tratamento eficaz destas infeções é de elevada importância. Para o desenvolvimento de novos tratamentos antimicrobianos é necessário compreender não só os mecanismos de ação dos antibióticos, como também os que estão subjacentes à resistência aos mesmos e que foram adquiridos por S. aureus. O problema mundial da (multi)resistência a antibióticos em conjunto com as dificuldades recorrentes em descobrir novos compostos eficazes no combate a infeções microbianas, requerem a urgente inovação no desenvolvimento de técnicas que auxiliem no processo de identificação de novos alvos. Limitações na diversidade de químicos eficazes e identificação de alvos, juntamente com reduzidas concentrações disponíveis de produtos naturais, levaram à estagnação do processo de descoberta de antibióticos. Como tal, as técnicas base envolvidas na descoberta de compostos antimicrobianos são atualmente combinadas, de forma a contornar as suas restrições individuais e possibilitar resultados mais robustos. Os ensaios de screening direcionados a alvos específicos são um exemplo claro desta inovação, analisando e comparando a resposta de estirpes geneticamente modificadas com a da estirpe parental. Podendo utilizar sistemas de fluorescência ou de bioluminescência e requerendo quantidades reduzidas de compostos de interesse/a testar durante os estudos/ensaios, este tipo de estirpes modificadas constituem ferramentas úteis para a descoberta de antibióticos, nomeadamente compostos derivados de produtos naturais. Considerando os alvos clássicos de antimicrobianos, estes tipos de screening realizados em células bacterianas possibilitam a descoberta de novos compostos que atuem em enzimas e/ou estruturas envolvidas na síntese da parede celular, metabolismo do ácido fólico, ribossomas, polimerases do RNA, entre outros alvos mais comuns. Todavia, ao aplicar estes screenings a alvos menos estudados e que estão envolvidos em processos igualmente essenciais como, por exemplo, a divisão celular, homeostasia da membrana celular ou biossíntese de ácidos gordos, poderão ser descobertos novos compostos, ou formas mais eficazes de utilizar os já conhecidos, para o tratamento de infeções por MRSA. Devido à constante interação com o ambiente externo e fatores de stress associados, as bactérias utilizam diversos mecanismos para manter a integridade celular, nomeadamente membranar, assegurando, assim, a sua sobrevivência. A membrana citoplasmática está, por isso, envolvida em inúmeros processos desde o transporte de moléculas, respiração, comunicação celular, produção de energia, até à manutenção da força protomotriz. A alteração do potencial de membrana, uma das componentes da força protomotriz, é integrada como estímulo ambiental pela cinase de histidina LytS do sistema regulatório LytSR, que posteriormente desencadeia (via LytR) a reposta celular adequada. Outra forma possível de ativar e induzir uma resposta do sistema LytSR tem por base a fosforilação do regulador de resposta LytR como resultado da acumulação metabólica de acetato em células que se encontram na presença de concentrações elevadas de glucose. A resposta celular mediada por LytR consiste na ativação dos genes do operão lrgAB. Este operão está envolvido na regulação do programa de morte celular programada e tolerância a antibióticos, como a penicilina, funcionando de modo oposto ao operão cidABC dado que os produtos destes genes são homólogos aos sistemas de bacteriófagos de antiholinas e holinas, respetivamente. Quando LytS deteta a dissipação do potencial de membrana, fosforila o ativador LytR que irá, consequentemente, induzir a expressão dos genes lrg. LrgA funciona como uma antiholina, contrariando o efeito de permeabilização membranar da holina CidA, impedindo, assim, a morte celular e subsequente lise. Outro parâmetro que contribui para a sobrevivência e homeostasia da membrana celular é a composição lipídica da mesma. As bactérias produzem ácidos gordos e fosfolípidos através de um sistema diferente do dos seres humanos e outros organismos eucariotas, sendo o metabolismo destes lípidos controlado pelo regulão fap desse mesmo sistema. No centro desta regulação encontra-se o repressor FapR, capaz de regular a sua própria expressão através do controlo do gene fapR que o codifica. Deste modo, a indução do regulão, por compostos que inibam as enzimas desta via de biossíntese lipídica, é conseguida após inibição da atividade do FapR. Por sua vez, repressão mediada pelo FapR é inibida aquando do aumento dos níveis intracelulares de malonil-CoA, um intermediário da biossíntese de ácidos gordos e fosfolípidos, cuja concentração pode ser aumentada ao bloquear/inibir um dos passos enzimáticos da via. Devido à importância desta via para a estabilidade/homeostasia da estrutura membranar, as várias enzimas da biossíntese de ácidos gordos e fosfolípidos podem teoricamente ser consideradas como alvos eficazes de antibióticos. O presente trabalho tem por objetivo a construção de novas ferramentas para a descoberta de compostos antimicrobianos através da modificação genética da estirpe MRSA JE2, de forma a construir novas estirpes repórter fluorescentes. Deste modo, as estirpes repórter construídas serão capazes de detetar a inibição ou dano de vias metabólicas ou estruturas essenciais para a célula bacteriana. Como a resposta bacteriana a vários estímulos ambientais tem por base a indução da expressão de genes específicos, neste trabalho foram escolhidos os sistemas ou vias que respondem à diminuição ou perda de potencial de membrana e à inibição da biossíntese de ácidos gordos para construção das estirpes repórteres. Desta forma as bactérias repórter construídas ficam fluorescentes após deteção de compostos que causam os fenótipos anteriores, e a sua resposta é quantificável com base na fluorescência apresentada. Para construção dos repórteres, o gene que codifica a proteína mNeonGreen foi colocado sob o controlo dos promotores do operão lrg e do regulão fap, que respondem à redução do potencial de membrana e inibição da síntese de ácidos gordos, respetivamente. Nesta dissertação, concluímos que a indução da expressão de mNeonGreen sob o controlo do promotor de lrg após diminuição do potencial de membrana era demasiado reduzida para este repórter ser considerado adequado num screening de bibliotecas de compostos naturais. Todavia, os resultados da indução do repórter fap apontam para uma duplicação dos níveis de fluorescência das células, o que indica que esta estirpe é uma ferramenta promissora para a descoberta de compostos antimicrobianos que atuam através da inibição da via de biossíntese dos ácidos gordos.The global threat of multidrug resistant Staphylococcus aureus to healthy individuals poses a pressing need to develop new tools and explore alternative targets for the discovery of new antibiotics derived from natural compounds against this human pathogen. In this work we aimed to construct new tools for antibiotic discovery by constructing reporter strains, in the background of methicillin-resistant S. aureus strain JE2, which sense inhibition/damage of essential metabolic pathway/structures in the bacterial cell. Bacteria respond to various environmental stresses by triggering the expression of specific genes. We have focused on the response to loss of membrane potential and inhibition of fatty acid biosynthesis and constructed reporter S. aureus strains that become fluorescent upon detection of compounds causing these phenotypes. This was achieved by placing the gene encoding the fluorescent protein mNeonGreen under the control of the lrg and fap promoters that respond to loss of membrane potential and inhibition of fatty acid biosynthesis, respectively. The lrg operon takes part in the response of LytSR, a two-component regulatory system that senses the decrease of membrane electric potential due to the ever-changing environmental conditions. This response is based on the activity of Lrg proteins, which attempt to prevent cell membrane permeabilization and therefore ensure survival of stressed bacterial cells. The fap regulon is monitored by FapR, a repressor which controls the status of fatty acid biosynthesis and phospholipid metabolism. When a compound interferes with this pathway, intracellular levels of malonyl-CoA increase and FapR repression is inhibited, allowing fap genes expression. We concluded that induction of mNeonGreen expression driven by the lrg promoter upon loss of membrane potential was too weak for these reporter strains to be used in high-throughput screenings. However, induction of fap led to a two-fold increase of cells fluorescence, indicating that this is a promising tool for the discovery of antimicrobial compounds that act through inhibition of fatty acid biosynthesis.Pinho, Mariana Gomes deLeão, Raquel SáRepositório da Universidade de LisboaDuarte, Andreia Monteiro2021-10-28T00:30:19Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/36166TID:202190943enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:32:37Zoai:repositorio.ul.pt:10451/36166Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:50:28.528009Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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