Role of PLCy1 in the resistance mechanism to Anti-EGFR therapy in metastatic colorectal cancer

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Duarte, Raquel Sofia Cruz, 1992-
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/33228
Resumo: Tese de Mestrado, Oncobiologia, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017
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spelling Role of PLCy1 in the resistance mechanism to Anti-EGFR therapy in metastatic colorectal cancerCancro colo-rectal metastáticoTerapêutica anti-EGFRCetuximabFosfolipase Cy1Resistência terapêuticaTeses de mestrado - 2017Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de Mestrado, Oncobiologia, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017Tumor metastases are responsible for approximately 90% of all cancer-related deaths. Cetuximab (Cetx) is a monoclonal antibody targeting the epidermal growth factor receptor (EGFR), which was recently approved for the treatment of metastatic colorectal cancer (mCRC). However, Cetx effectiveness is only about 20% due to the existence of multiple resistance mechanisms downstream of EGFR. KRAS mutations are recognized as a predictor of resistance to anti-EGFR treatment, nevertheless, 54% of wild-type KRAS patients still do not respond to this therapy. Therefore, there is a clear need for new biomarkers capable of accurately predict response to therapy. PLCγ1 is activated by direct binding and phosphorylation by EGFR and has been implicated in oncogenic signaling downstream of this receptor. PLCγ1 catalyzes the hydrolysis of the membrane phospholipid phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) into diacylglycerol (DAG) and inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3), involved in diverse cellular processes, such as cell proliferation, differentiation and motility. In this thesis, we investigate the contribution of PLCγ1 for the resistance mechanism to Cetuximab, in an in vitro and a clinical approach. Overall, our results show that PLCγ1 is highly expressed in Cetuximab-resistant colon cancer cell lines. PLCγ1 knockdown in resistant cell lines (CACO-2 and HT-29) was able to sensitize them to Cetx. Furthermore, PLCγ1 overexpression in the most sensitive cell line (SW48) confers increased Cetuximab resistance. Additionally, SW48 cell line that was continuously exposed to Cetx for five months shows a slightly increase in PLCγ1 expression when compared with parental control. Finally, immunohistochemical analysis of PLCγ1 in human CRC samples shows an association between increased PLCγ1 expression and poor progression-free survival of patients under Cetx treatment. Taking together, our results show a correlation between PLCγ1 expression levels and Cetuximab resistance, suggesting that PLCγ1 could be a predictive biomarker of EGFR resistance, helping selecting patients more likely to respond to this therapy.O cancro colo-rectal é o terceiro cancro mais incidente a nível mundial, com a quarta maior taxa de mortalidade. A elevada mortalidade associada a este tipo de cancro é essencialmente devida à acrescida dificuldade no tratamento da doença metastática. Nos últimos anos, o desenvolvimento e utilização de novos fármacos, como os anticorpos monoclonais dirigidos contra o recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), têm aumentado a eficácia das terapêuticas convencionais em tumores metastáticos. No entanto, existe ainda um grande número de doentes que não responde a estas terapêuticas ou que acaba por desenvolver resistência às mesmas, após um período inicial de tratamento. Dado este cenário, torna-se cada vez mais urgente a procura de novos biomarcadores, mais sensíveis e específicos, que possam indicar com maior clareza quais os pacientes que beneficiam destas terapêuticas. O EGFR está implicado no desenvolvimento e progressão de múltiplos tumores, nomeadamente nos casos de cancro colo-rectal. A ativação deste recetor conduz à ativação de várias vias de sinalização celulares implicadas no controlo da sobrevivência celular, progressão do ciclo celular, angiogénese, migração e invasão/metastização. O Cetuximab (Cetx) é um anticorpo monoclonal direcionado especificamente contra o EGFR, que se liga à sua porção extracelular com uma afinidade superior à dos seus ligandos endógenos. Desta forma, o Cetx bloqueia a ligação dos ligandos ao EGFR, impedindo a ativação do recetor, o que se traduz na inibição das vias intracelulares e dos processos por elas regulados. Além disso, o Cetx induz a internalização do EGFR levando à diminuição dos recetores disponíveis na superfície celular. Finalmente, o Cetx permite ainda o reconhecimento das células tumorais pelas células efetoras imunitárias citotóxicas, desencadeando o processo de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo. Infelizmente, apenas um pequeno número de pacientes responde eficazmente a esta terapêutica. Mutações ativadoras no gene KRAS, que codifica para uma proteína a jusante na via de sinalização do EGFR, estão já identificadas como fortes indicadores de resistência ao Cetuximab, uma vez que ativam constitutivamente as vias intracelulares, de forma independente do recetor. Ainda assim, 54% dos doentes que não apresentam mutações neste gene desenvolvem resistência (intrínseca ou adquirida) a esta terapêutica. A ativação constitutiva de outros efetores intracelulares, tais como BRAF, PI3K e PLCγ, pode também constituir um mecanismo de resistência à terapia anti-EGFR, sendo que a PLCγ nunca foi anteriormente estudada neste contexto. Existem duas isoformas da PLCγ, a PLCγ1 e a PLCγ2, sendo que a primeira é amplamente expressa, estando presente em quase todos os tecidos, e a segunda é expressa essencialmente em células do sistema imune. Ambas as PLCγ são diretamente ativadas por recetores do tipo tirosina cinase, dos quais fazem parte o EGFR, e, quando ativas, são responsáveis pela conversão do fosfolípido de membrana fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) em dois mensageiros secundários, o diacilglicerol (DAG) e o inositol trifosfato (IP3). Estes mensageiros secundários são essenciais para a regulação de múltiplos processos celulares como proliferação, diferenciação, migração e angiogénese. Diversos estudos demonstraram que a PLCγ1 possui um papel importante no desenvolvimento e progressão tumoral, nomeadamente ao nível da migração celular. Neste sentido, o knockdown da expressão da PLCγ1 numa linha celular de carcinoma mamário (MDA-MB-231) inibiu o desenvolvimento de metástases pulmonares em modelo animal de ratinho. Por outro lado, a sobre-expressão de PLCγ1 foi observada em diversos tipos de tumores, incluindo colo-rectais, quando comparados com tecidos normais adjacentes, e foi associada a um pior prognostico e a um risco aumentado de desenvolvimento de metástases à distancia. Para além deste facto, mutações no gene PLCG1 foram recentemente associadas com o desenvolvimento de angiossarcomas e linfomas cutâneos de células T. Finalmente, apesar de pouco estudada no contexto de resistência à terapêutica, mutações no gene da PLCG2 (isoforma maioritariamente expressa em células hematopoiéticas) foram associadas ao mecanismo de resistência ao Ibrutinib, um inibidor da tirosina cinase de Bruton, no tratamento de leucemia linfocítica crónica. Tendo em conta o papel da PLCγ1 na regulação de processos celulares como a migração, invasão e progressão tumoral, e a sua estreita relação com o recetor EGFR, o principal objetivo deste trabalho é explorar a hipótese do envolvimento da PLCγ1 no mecanismo de resistência à terapêutica anti-EGFR. Para testar esta hipótese começou-se por avaliar a resposta de um painel de cinco linhas celulares de cancro colo-rectal (todas KRAS wild-type) ao tratamento com Cetuximab e correlacionar essa resposta com o nível de expressão da PLCγ1. Os nossos resultados mostram que os níveis de expressão da PLCγ1 estão aumentados nas linhas celulares mais resistentes ao Cetuximab, quando comparados com os níveis de expressão das linhas mais sensíveis. De seguida, foi realizada a sobre--expressão da PLCγ1 na linha mais sensível (SW48), enquanto que na linha mais resistente (CACO-2) foi realizado o knockdown da expressão da PLCγ1. O Knockdown da expressão da PLCγ1 na linha CACO-2 permitiu sensibilizá-la de forma significativa (p=0,0289) ao tratamento com Cetx. Por outro lado, a sobre-expressão da PLCγ1 na linha SW48 fez com que esta aumentasse a resistência ao tratamento com Cetuximab. A sobre-expressão de um mutante PLCγ1 constitutivamente ativo na sua função lipase (ΔSA), não mostrou diferenças na resposta ao Cetuximab quando comparada com o controlo. Estes resultados indicam um possível mecanismo de resistência independente da função lipase da PLCγ1. Simultaneamente, uma linha celular com sensibilidade intermedia ao Cetx (HT-29) mas com mutação ativadora do gene BRAF, foi também selecionada para se realizar o knockdown da expressão da PLCγ1. Mais uma vez, o knockdown da expressão da PLCγ1 permitiu também aumentar a sensibilidade das células ao Cetx (p=0,0222), mesmo na presença de uma mutação ativadora no gene do BRAF (V600E). Por fim, a linha SW48 foi também continuamente exposta a elevadas concentrações de Cetuximab por um período de cinco meses, a fim de avaliar um possível envolvimento da PLCγ1 na resistência adquirida ao Cetx. Neste caso, foi possível ver um aumento de expressão da PLCγ1, comparativamente com as células parentais não tratadas. De uma forma geral, os nossos resultados sugerem que o aumento da expressão desta proteína poderá estar associado não só a um mecanismo de resistência inato ao tratamento, mas também a um mecanismo adaptativo de resistência ao Cetx. Por fim, a expressão da PLCγ1 foi avaliada num grupo retrospetivo de amostras (n=25) de casos de carcinoma colo-rectal, provenientes do serviço de anatomia patológica do Hospital de Santa Maria. Estas amostras correspondem a amostras de tumores primários de doentes tratados com Cetuximab em contexto da doença metastática. A expressão da PLCγ1 foi avaliada por imunohistoquímica e os resultados foram analisados por um médico patologista, que realizou um score de intensidades de marcação. A elevada expressão da PLCγ1 foi significativamente associada (p=0,0460) a uma diminuição no tempo de sobrevivência livre de progressão, em doentes sob tratamento com Cetx. Observou-se também uma tendência entre maiores níveis de expressão de PLCγ1 e uma diminuição da sobrevivência global, sem, no entanto, existir significância estatística. Em conclusão, os resultados obtidos neste trabalho sugerem uma associação negativa entre os níveis de expressão da PLCγ1 e a resposta ao Cetuximab. Esta relação foi observada nos estudos in vitro e na avaliação de amostras de pacientes. O aumento da expressão da PLCγ1 pode também estar associado ao desenvolvimento de resistência adquirida ao Cetuximab. Demonstrar o envolvimento da PLCγ1 em mecanismos de resistência ao Cetuximab, e possivelmente a outras terapias anti-EGFR, poderá ter um grande impacto clínico no tratamento do cancro colo-rectal metastático, não só como potencial biomarcador preditivo de resposta à terapêutica, mas também como um possível novo alvo terapêutico.Martins, Marta Sofia AlvesRepositório da Universidade de LisboaDuarte, Raquel Sofia Cruz, 1992-2019-05-08T00:30:30Z20172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/33228TID:201606496enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:28:05Zoai:repositorio.ul.pt:10451/33228Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:48:22.020487Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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