Estudo protocolar por RMN na análise do metaboloma das saccharomyces cerevisiae

• Autor(a) principal: Santos, Cláudio Henrique dos
• Data de Publicação: 2009
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10773/4867
• topic: Métodos biomoleculares; Metabolismo celular; Metabolitos; Leveduras; Espectroscopia de ressonância magnética nuclear

Este trabalho focou-se na optimização de um processo que possibilitasse a obtenção de perfis globais metabólicos, por NMR, e na identificação do maior número de metabolitos intracelulares das leveduras Saccharomyces cerevisiae com erros de tradução. O método experimental a utilizar na extracção de metabólicos intracelulares em células eucarióticas para análise por NMR, deve preencher determinados requisitos: rendimento elevado, reprodutibilidade, simplicidade e rapidez. Existem vários factores que influenciam este estudo. Com o intuito de encontrar um método eficaz, analisaram-se todas as variáveis a controlar, estudando-se: os meios de crescimento; as curvas de crescimento, de forma a saber onde recolher as células ao longo do seu crescimento; e alguns procedimentos de extracção dos metabolitos. Obtidos os extractos metabólicos (<5 kDa) através de diferentes métodos, adquiriram-se espectros 1D e, para amostras seleccionadas, 2D 1H-13C-HSQC. Usando a análise por PCA identificaram-se algumas variáveis experimentais, posteriormente controladas de forma a diminuir a variabilidade entre amostras e encontrar um processo de obtenção de extractos metabólicos eficiente. O método optimizado apresenta semelhanças com o método utilizado por Lewis et al, no qual são usadas duas fases de liofilização. Ao fim da primeira liofilização, adicionam-se esferas de vidro (5 mm) aos extractos liofilizados, seguidamente vortexados a seco. Posteriormente é filtrado (< 5 kDa) e liofilizado novamente. Este trabalho também passou pela identificação de um maior número de metabolitos característicos das Saccharomyces cerevisiae. Em trabalhos anteriores, o número conhecido é de 40 metabolitos e, no nosso caso, são apresentados cerca de 60 compostos claramente identificados recorrendo à técnica de NMR.