The role of the restriction-modification system of Clostridium pasteurianum on its electro-transformation

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Magalhães, Carla Isabel Pereira
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/1822/28631
Resumo: Dissertação de mestrado em Bioengenharia
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spelling The role of the restriction-modification system of Clostridium pasteurianum on its electro-transformation579.85Dissertação de mestrado em BioengenhariaClostridium pasteurianum is a Gram-positive and anaerobic bacterium with a great biotechnological potential. It is one of the few microorganisms capable of hydrolyzing glycerol to produce solvents as ethanol and butanol, which have a wide applicability in the market as biofuels. The development of a genetic system for this microorganism would increase its application opportunities since gene overexpression or inactivation could improve their solventogenic characteristics. Its genetic information is already known but this organism has a particular resistance to transformation. This resistance can be explained by a very efficient restriction system that does not allow the entrance of non-methylated DNA or DNA with a methylation pattern different from it. Therefore, foreign DNA must be correctly methylated prior to transformation. For this purpose, a specific methyltransferase is needed to transfer methyl groups to a certain nucleotide of a specific sequence. The goal of this thesis was to create a genetic system in C. pasteurianum that allows genome modification and foreign protein expression, ultimately improving C. pasteurianum DSM 525 transformation. Preliminary simple electro-transformations in which the parameters to make competent cells and the electroporation conditions were altered, did not result in positive results. Being aware of the possibility of a restriction system presence in this organism, experiments with M.MspI methylated DNA were performed, however they demonstrated the inability of this methyltransferase to improve the microorganism transformation. The presence of restriction enzymes was confirmed when a characterization of the restriction system of C. pasteurianum was performed using MspI methylated and non-methylated DNA. The presence of a discrete digestion pattern was detected, and M.MspI methylation could not protect the foreign DNA from C. pasteurianum restriction action. The polyamine spermidine, with known affinity for negatively charged DNA, showed to be efficient against C. pasteurianum crude extract digestion action, however not sufficiently to facilitate this microorganism electrotransformation. By accessing the genome information, the Restriction/Modification (R/M) systems of this microorganism were analyzed. The GATC type IIP R/M system was chosen in order to verify the restriction and methylation enzymes activity with the same target sequence. Three genes, one REase (DpnII) and two MTases (Dam and MdpnII) were cloned in pETduet-1, followed by overproduction in BL21 (DE3). The codon usage of the host and original organism were not compatible, and the protein production in tRNAs provider strains was tested. Protein production was detected, however was not possible to re-confirm their presence. The common protein folding problems were analyzed using a disulfide bond enhancer strain. Nevertheless, the production problem may not be related to this, since no different protein over-production was detected. Restriction reactions with the REase BstUI and C. pasteurianum crude extract, using DNA methylated by M.SssI (m5CG), were developed and showed that the REase responsible for hindering foreign DNA entering C. pasteurianum recognizes the sequence 5'-CGCG- 3'. In a second analysis of the C. pasteurianum genome a methyltransferase-encoding gene was identified that may be involved in methylating the sequence 5'-CGCG- 3'. The in silico analysis was performed and its codon usage was also improved to be compatible with E. coli. In this work, the reasons for C. pasteurianum’s recalcitrance to transformation were identified, the knowledge about its R/M systems was extended, and a proposal to efficiently transform this bacterium was provided.Clostridium pasteurianum DSM 525 é uma bactéria Gram-positiva anaeróbia com um elevado potencial biotecnológico. Este é um dos poucos microrganismos capaz de hidrolisar glicerol para produzir solventes como etanol e butanol, que têm uma grande aplicabilidade no mercado. O desenvolvimento de um sistema genético para este organismo permitiria aumentar as suas oportunidades de aplicação sendo que a sobre-expressão ou inativação de um determinado gene pode melhorar as suas características solventogénicas. A sua informação genética já é conhecida, mas este microrganismo apresenta uma particular resistência à transformação. Esta resistência pode ser explicada pela presença de um eficiente sistema de restrição que não permite a entrada de DNA não metilado ou DNA metilado de forma diferente da própria bactéria. Desta forma, o DNA estranho deve ser corretamente metilado antes da transformação. Para que isto seja possível é necessária a presença de uma metilase específica para transferir grupos metilo para um determinado nucleótido de uma sequência específica. O objetivo desta tese foi criar um sistema genético em C. pasteurianum que permitisse modificações no genoma e a expressão de proteínas heterólogas, ou seja, que permitisse melhorar a transformação de C. pasteurianum DSM 525. Foram realizadas transformações preliminares simples com parâmetros que diferem na forma de obter células competentes e nas condições de eletroporação, contudo os resultados obtidos não foram positivos. Tendo conhecimento da possibilidade da presença de um sistema de restrição neste organismo, foram realizadas experiências com DNA metilado pela enzima M.MspI, sendo que estas demonstraram a incapacidade da metiltransferase para melhorar a transformação deste microrganismo. Foi confirmada a presença de enzimas de restrição aquando da caracterização do sistema de restrição de C. pasteurianum usando DNA não metilado ou metilado pela enzima M.MspI. Foi detetada a presença de um padrão de digestão distinto, verificando-se que a enzima M.MspI não consegue proteger o DNA estranho da ação de restrição de C. pasteurianum. A poliamina espermidina, com conhecida afinidade por DNA negativamente carregado, mostrou ser eficiente contra a ação de digestão do extrato cru de C. pasteurianum, contudo não o suficiente para facilitar a electrotransformação deste microrganismo. Tendo acesso ao genoma, foi então analisado o sistema de Restrição e Modificação (R/M) deste microrganismo. Foi escolhido o sistema R/M tipo IIP GATC para verificar a atividade de enzimas de restrição e metilação com a mesma sequência de reconhecimento. Foram clonados três genes no vetor pETduet-1, uma enzima de restrição (REase – DpnII) e duas metiltransferases (MTases – Dam and Mdpn), seguindo-se a produção em BL21 (DE3). O conjunto de codões usados pelo hospedeiro e pelo organismo de origem não eram compatíveis, foi então testada a produção proteica em estirpes fornecedoras de tRNAs. Foi observada produção proteica contudo não foi possível re-avaliar a sua presença. Foram analisados problemas de enrolamento (do inglês folding), usando uma estirpe que facilita a formação de pontes dissulfito. No entanto, o problema na produção não deve estar associado ao enrolamento proteico sendo que não foi detectada produção proteica nestas condições. Foram desenvolvidas reações de restrição com a REase BstUI e extrato cru de C. pasteurianum usando DNA metilado pela enzima M.SssI (m5CG) e foi mostrado que a REase responsável pelo impedimento da entrada de DNA em C. pasteurianum reconhece a sequência 5'-CGCG- 3'. Numa segunda análise ao genoma de C. pasteurianum DSM 525 foi identificado um gene que codifica uma metiltransferase que pode estar envolvida na metilação da sequência 5'-CGCG- 3'. Foi feita a análise in silico e o tipo de codões usados foi melhorado para ser compatível com E. coli. Neste trabalho, foram identificadas as razões para a resistência deste microrganismo à transformação, foi consolidado o conhecimento sobre o seu sistema de R/M e foi proposta uma metodologia para transformar de forma eficiente esta bactéria.Mota, M.Kluskens, LeonUniversidade do MinhoMagalhães, Carla Isabel Pereira20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/1822/28631eng201086476info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-21T12:50:56Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/28631Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T19:49:43.087706Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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