Development of a VLP-based HCV vaccine candidate

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Fernandes, Marina Isabel Ferreira
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/25377
Resumo: Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016
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spelling Development of a VLP-based HCV vaccine candidateHCVVLPVetores lentiviraisRMCEVacinasTeses de mestrado - 2016Departamento de Biologia VegetalTese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016The Hepatitis C Virus (HCV) infects approximately 3% of the world population, being one of the major causes of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The development of safe, effective and affordable prophylactic and therapeutic vaccines against HCV has become an important medical priority; however, there are many obstacles to its development. In recent years, strategies of viral antigen delivery, as virus-like particles (VLPs), have been developed for use in vaccines and marketed, as Human Papillomavirus (HPV) vaccine. The main objective of this work consists in the development and production of HCV-like particles as HCV vaccine candidates. We started by evaluating two different cell substrates – HEK293 and HuH-7 - for HCV-LPs production. HEK293 and HuH-7 cell lines were transduced with three cassettes constructed with a lentiviral backbone that code for HCV genes. The mRNA, as well as protein of all viral components was detected in transduced cells. Afterwards, HCV-LPs were purified using sucrose cushion ultracentrifugation. The impact of Fetal Bovine serum (FBS) reduction of concentration in HCV-LPs production was also analyzed. Our results indicate that HEK293 produced HCV-LPs are similar to those produced in HuH-7 cells with the advantage of their slightly higher production yields. Therefore, we proceed with the development of a stable cell line using defined gene expression loci, using a tagging and targeting strategy. We started by tagging HEK293 cells with pTagFRT_mCherry expression cassette. After 72 hours under selective hygromycin pressure we obtained different cell populations with heterogeneous mCherry fluorescence intensity. These populations were independently subjected to limiting dilution to isolate homogeneous individual cell clones. 16 clones were analyzed for mCherry expression and the 10 clones showing higher mCherry fluorescence were screened by RT-qPCR for single-copy integration of tagged mCherry cassette. For those clones with single copy integration, we evaluated functionality of the genetic construct by assessing retroviral vector production. Clones #206 and #311 were chosen to produce HCV-LPs. Clones #206 and #311 were transfected with the pTarLoxP_E1E2, a targeting vector expressing HCV envelope proteins. Puromycin resistant cells, indicative of Cre-mediated cassette exchange, were obtained from clone #311, that shown 7% of cassette exchange efficiency. A limiting dilution was performed to isolate targeted. Clone #311_F8 was chosen for expansion and Flipase cassette exchange. Thus, parental clone #311 and clone #311_F8 were transfected with the exchange vector pTarFRT_Core, antibiotic selection and clone expansion of resistant cells is still ongoing. This work directly contributes to the development HCV-like (HCV-LP) particles that mimic HCV structure and antigen display thus contributing for the development of a vaccine against HCV.O Vírus da Hepatite C (HCV) infeta aproximadamente 3% da população mundial, sendo uma das principais causas de cirrose e carcinoma hepatocelular. O desenvolvimento de uma vacina efetiva e segura, profilática e terapêutica contra o HCV é urgente, de forma a controlar a epidemia global. No entanto, existem diversos obstáculos para o seu desenvolvimento, incluindo a elevada variabilidade do genoma do HCV, a falta de sistemas de cultura eficientes para a replicação do vírus infecioso e de modelos animais para estudar a replicação do HCV e a sua patogénese. Considerando estes obstáculos, nos anos mais recentes, estratégias de entrega de antigénios virais, como as partículas semelhantes a vírus (VLPs), têm sido desenvolvidas para o uso em vacinas, como é o caso da vacina contra o Vírus do Papiloma Humano (HPV). O principal objetivo deste projeto é o desenvolvimento e produção de HCV-LPs como candidatas a uma vacina contra o HCV. Uma linha celular estável pode ser usada como produtora de VLPs, contudo, o seu desenvolvimento é significativamente moroso e laborioso. Além disso, e independentemente do sistema de expressão, quando se pretende expressar biofármacos multiméricos, como as VLPs, o rendimento é geralmente muito baixo. De forma a superar estas limitações, para o projeto foram estabelecidos dois objetivos: a avaliação de duas linhas celulares diferentes (HEK293 e HuH-7) transduzidas com vetores lentivirais com os genes do HCV necessários para produção de HCV-LPs e, posteriormente, o desenvolvimento de uma linha celular estável derivada de HEK293, usando a tecnologia de troca de cassete mediada por uma recombinase (RMCE). Os vetores lentivirais têm sido utilizados como uma ferramenta de terapia génica uma vez que são capazes de transferir um grande inserto exógeno para as células-alvo, podendo ser utilizados como vetores para o tratamento de diversas patologias, como por exemplo, doenças neurológicas e síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA); possuem uma baixa imunogenicidade e são capazes de transformar geneticamente as células em não divisão como os hepatócitos, ao contrário de outros tipos de vetores virais. A produção de vetores lentivirais é realizada em células de mamíferos, geralmente, com origem humana ou de ratinho, e requer a utilização de quatro cassetes de expressão independentes, no caso do sistema de terceira geração, que codificam gag-pro-pol (proteínas virais estruturais e enzimáticas), rev (proteína auxiliadora), env (glicoproteínas do envelope) e o transgene, que contém o gene de interesse clonado no esqueleto do genoma viral. Cada estágio de inserção requer a seleção por antibiótico, de acordo com a marca de seleção incluída na cassete com o transgene. Por outro lado, os sistemas de RMCE têm sido utilizados para introduzir cassetes de expressão em regiões pré-definidas do genoma celular por intermédio de uma reação de recombinação homóloga de recombinases, que envolve dois passos. O primeiro consiste na introdução de uma cassete “tagging” flanqueada por duas sequências RT (do inglês, recombination target sites) heteroespecíficas incompatíveis no genoma celular. Este processo de integração no genoma celular ocorre de uma forma aleatória. O segundo consiste na troca da cassete por uma cassette “targeting” flanqueada pelas mesmas sequências RT heteroespecíficas e este processo é mediado por uma recombinase. Como dito anteriormente, o trabalho desenvolvido neste projeto começou por centrar-se na avaliação de duas linhas – HEK293 e HuH-7 – para produção de HCV-LPs. Para tal, foram contruídos cinco vetores lentivirais no sentido de expressarem os genes do HCV (Core, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b e NS5a). As células foram transduzidas sequencialmente por três destes vetores e selecionadas, respetivamente, consoante a marca de seleção presente na cassete com o transgene. Posteriormente à seleção, analisou-se a expressão dos genes do HCV e das respetivas proteínas das células transduzidas e verificou-se que todos os componentes virais estavam a ser expressos. No entanto, a deteção da expressão das proteínas p7 e NS2 não foi possível uma vez que não há anticorpos disponíveis comercialmente para a estirpe de HCV em estudo. Uma vez confirmado que as proteínas estruturais estavam a ser expressas e, portanto, cumpridos os requisitos essenciais para se obterem HCV-LPs, avaliou-se a produção de HCV-LPs. Então, recorreu-se ao método de centrifugação da “cama” de sucrose para se purificarem as psedopartículas. Tendo em conta os rendimentos de HCV-LPs obtidos pós-purificação, as linhas celulares HEK293 parecem ser um bom substrato celular para a sua produção. Um estudo sobre a influência de soro fetal bovino (FBS) na produção de HCV-LP também foi realizado, em colaboração com o Downstream Process Development Laboratory, e verificou-se que, de forma geral, a produção de HCV-LPs diminuiu para HEK293 e HuH-7, quando as concentrações de soro foram reduzidas. O segundo objetivo desta tese consistiu no desenvolvimento de uma linha celular estável produtora de HCV-LPs. Para o funcionamento do sistema RMCE foram necessárias duas cassetes distintas e complementares (“tagging”/”targeting”). As cassetes tagging pTagLoxP_GFPZeo e pTagFRT_mCherry expressavam os genes repórtes GFP e mCherry, respetivamente. Por outro lado, as cassetes targeting pTarLoxP_E1E2 e pTarFRT_Core expressavam, respetivamente, os genes E1 e E2 e Core do HCV. Em ambas as situações, a expressão da marca de seleção foi necessária para garantir a expressão estável das cassetes no genoma da célula. Enquanto a integração da cassete tagging no genoma se dá através de um processo aleatório, a integração da cassete targeting é o resultado da troca eficiente por recombinação de locais específicos mediada por uma recombinase. Os clones #1, #2 e #3 de HEK293 que apresentavam previamente a cassete tagging pTagLoxP_GFPZeo foram transfetados com uma segunda cassete tagging pTagFRT_mCherry e colocadas em seleção com higromicina. As três populações apresentaram distribuições de fluorescência diferentes. De forma a obterem-se células homogéneas com níveis de expressão de mCherry semelhantes, fez-se um limiting dilution para se isolarem clones. Obtiveram-se 16 clones, que foram, posteriormente, analisados quanto à percentagem do número de células mCherry positivas e apenas 10 apresentaram elevada percentagem. Estes clones foram analisados por citometria de fluxo para comparar o nível de expressão de mCherry. Antes do processo da troca da cassete, é importante que apenas uma cópia da cassete tagging seja integrada no genoma da célula para que o sistema RMCE seja funcional. Portanto, foi implementado um protocolo de RT-qPCR para analisar o número de cópias integradas da cassete tagging em cada clone relativamente a um controlo com uma única cópia. Considerando valores entre 0.6 e 1.4, como descrito por Bodin et al (2005), 6 dos 10 clones analisados mostraram a integração de uma única cópia. Posteriormente, desses clones foram escolhidos 4 (#103, #206, #301 e #311) para serem analisados quanto ao sinal de empacotamento (Ψ) colocado na cassette e os clones #206 e #311 foram selecionados para se proceder a recombinação homóloga. Estes dois clones foram assim co-transfetados com a cassete target pTarLoxP_E1E2 e com o plasmídeo que expressa a enzima recombinase Cre pelos métodos de transfeção polietilenimina (PEI) e fosfato de cálcio (CaPO4). As células resistentes à puromicina, sugerindo o sucesso da troca da cassette, foram obtidas, mas apenas do clone #311, que revelaram por citometria de fluxo uma eficiência de troca de 7% para ambos métodos de transfeção. Estas células foram isoladas, obtendo-se 1 clone (#311_F8) com sinal mCherry positivo e GFP negativo. Este clone foi expandido e, posteriormente, foi co-transfectado com a segunda cassete target pTarFRT_Core utilizando novamente os métodos de PEI e CaPO4. Neste momento, as células encontram-se sob seleção com neomicina. Este trabalho contribuiu diretamente para o desenvolvimento de partículas HCV-LPs que mimetizam a estrutura do HCV e a exposição do antigénio e contribui assim para o desenvolvimento de uma vacina contra o HCV.Coroadinha, Ana SofiaMatos, Ana Rita Barreiro Alves de, 1975-Repositório da Universidade de LisboaFernandes, Marina Isabel Ferreira2016-12-22T11:20:50Z201620162016-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/25377TID:201617005enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:15:04Zoai:repositorio.ul.pt:10451/25377Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:42:24.082858Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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