Biophysical characterization of sarcosine oxidase: effect of physical and chemical parameters on sarcosine oxidase activity

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Damião, Cátia Sofia Santos
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/43346
Resumo: Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019
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spelling Biophysical characterization of sarcosine oxidase: effect of physical and chemical parameters on sarcosine oxidase activitySarcosine oxidaseEnzyme-coupled colorimetric assaySarcosineTemperatureProstate cancerMestrado Integrado - 2019Ciências da SaúdeTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019As flavoproteínas integram um grupo de proteínas fundamentais nas áreas da bioquímica e enzimologia correspondendo aproximadamente a 1% de todas as proteínas documentadas. Esta família de enzimas participa em diversos processos biológicos desde a reparação do DNA celular ao metabolismo de fármacos. De entre as inúmeras flavoenzimas já identificadas, destaca-se a sarcosina oxidase (SOX), uma oxidoredutase monomérica de 43 kDa com diversas aplicações clínicas. A SOX é considerada um agente de diagnóstico fundamental para a determinação dos níveis de creatinina possibilitando a avaliação da função renal quando utilizada em combinação com a creatinase e creatininase. Para além disso, a SOX pode ser potencialmente utilizada para determinar outras moléculas como por exemplo a sarcosina, sendo a sua quantificação possível graças a um método colorimétrico enzimático acoplado. Neste trabalho pretendeu-se obter uma melhor compreensão das propriedades físicas e químicas desta flavoproteína de forma a otimizar o seu desempenho na reação catalítica. A caracterização enzimática da SOX foi realizada através de uma reação específica baseada na formação de peróxido de hidrogénio, a partir de sarcosina, reação mediada por esta enzima. O peróxido de hidrogénio resultante reage por sua vez com a 4-aminoantipirina na presença de fenol e de peroxidase originando um produto final de cor violeta, a quinoneimina, que pode ser detetada espectrofotometricamente. Para além das propriedades espectrais, a influência da temperatura reacional sobre a reação catalítica assim como os parâmetros cinéticos foram investigados. Foi também estudado o efeito do pH e tempo de reação na atividade da enzima. Os resultados mostraram uma boa tolerância da enzima, a pH 8.0, a temperaturas elevadas refletindo uma potencial aplicação em indústrias biotecnológicas. Os ensaios efetuados também demonstraram que a ureia não apresenta uma interferência significativa na atividade da SOX. Este trabalho abre perspetivas para a quantificação da sarcosina através da utilização da SOX, sendo útil para o diagnóstico do cancro da próstata. Deste modo, a técnica proposta poderá ser uma ferramenta promissora para diferenciar doentes com cancro da próstata de indivíduos saudáveis ou mesmo de doentes com hiperplasia benigna da próstata de acordo com os níveis urinários de sarcosina.Flavoproteins remain key players in enzymology and biochemistry corresponding approximately to 1% of all documented proteins. The members of this enzyme family are involved in several biological processes from cell DNA repair to drug and xenobiotic metabolism. Among the several flavoenzymes identified to date, sarcosine oxidase (SOX) is a two domain monomeric oxidoreductase protein of 43 kDa with many clinical applications. Monomeric sarcosine oxidase (MSOX) can be used as a diagnostic tool to evaluate the renal function since it has the capacity, when in combination with cretinase and creatininase, for assaying creatinine levels in human serum. Apart this, SOX has the potential to be used for the measurement of other analytes, such as sarcosine, by employing an enzyme-coupled colorimetric assay. The main aim of this work was to characterize some biochemical and physical properties of MSOX, namely its optimum catalytic conditions, in order to improve its redox activity. For this purpose, a coupled colorimetric method was utilized based on hydrogen peroxide (H2O2) formation via SOX. The produced H2O2 reacts further with 4-aminoantipyrine (4-AAP) in the presence of horseradish peroxidase (HRP) to produce a violet product, quinoneimine, which can be measured spectrophotometrically. Apart from the spectral properties, the influence of reactional temperature and the presence of urea upon the catalysis of the enzyme and the kinetics parameters of the MSOX were investigated. The effect of pH on the electrophoretic mobility of the native enzyme was also studied. The obtained data showed a good tolerance of the enzyme at pH 8.0 to high temperatures which infers a potential application in various biotechnological industries. The experimental results also showed no significant interference from urea. This study provides a rapid and simple tool to determine sarcosine levels which can be useful for prostate cancer diagnosis. Therefore, this method is promising to distinguish prostate cancer patients from healthy or benign prostatic hyperplasia subjects according to urinary sarcosine level.Prevention Medicals, Veterinárni a Farmaceutická Univerzita Brno, Hospital da Luz, Farmácia QuintelaKizek, RenéLeandro, Ana Paula Costa dos Santos PeraltaRepositório da Universidade de LisboaDamião, Cátia Sofia Santos2020-05-04T22:58:29Z2019-12-302019-11-152019-12-30T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/43346TID:202474666enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:43:45Zoai:repositorio.ul.pt:10451/43346Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:56:10.403928Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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