Role of long non-coding RNAs in parasite differenciation
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| Data de Publicação: | 2015 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/22475 |
Resumo: | Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015 |
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Role of long non-coding RNAs in parasite differenciationTrypanosoma bruceiBiologia molecular e genéticaTeses de mestrado - 2015Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015O Trypanosoma brucei é um organismo eucariota unicelular responsável pela Doença do Sono. O parasita pertence à ordem Kinetoplastida, caracterizada por uma estrutura que contém DNA mitocondrial designada cinetoplasto. A distribuição da doença é condicionada pela localização do vector que transmite o parasita. A doença é caracterizada por dois estadios: no primeiro, o parasita está restrito ao sangue e ao linfa e, no segundo, o parasita atravessa a barreira hematoencefálica e invade o sistema nervoso central, causando distúrbios no ciclo do sono. Esta doença endémica da África subsariana é letal se não for tratada. Atualmente, não existe ainda uma vacina e o seu tratamento, além de dispendioso, gera efeitos secundários indesejados. Ao longo do seu complexo ciclo de vida, o parasita alterna entre o seu hospedeiro, um mamífero, e o seu vector, a mosca tsé-tsé. Aquando da picada da mosca tsé-tsé, o parasita entra na corrente sanguínea do hospedeiro e diferencia-se em slender forms. Os parasitas slender forms reproduzem-se assexuadamente por fissão binária, estabelecendo e mantendo a infecção no hospedeiro. O parasita apresenta na sua superfície uma proteína designada glicoproteína variante de superfície (VSG). A rápida e periódica mudança da VSG, designada variação antigénica, permite ao parasita escapar do sistema imunitário do hospedeiro, o que leva a um combate pouco eficiente contra a infecção, já que o parasita consegue persistir durante anos no mesmo hospedeiro. Quando a população do parasita atinge grandes concentrações no sangue, um mecanismo de quorum-sensing permite a diferenciação de slender forms para stumpy forms. Os parasitas stumpy forms são a sua forma transmissível e pré-adaptada para sobrevivência no intestino da mosca tsé-tsé. Ao contrário dos slender forms, os stumpy forms diferenciam-se em procyclic forms, aquando da picada da mosca tsé-tsé, o que leva à transmissão do parasita para o seu vector. T. brucei apresenta uma expressão génica pouco comum comparando com outros organismos eucariotas, uma vez que os genes estão organizados em unidades transcricionais policistrónicas (PTU) constituídas por vários genes não-relacionados funcionalmente e transcritos a partir de um promotor comum. Uma vez transcrito um RNA percussor policistrónico, o transcrito é processado em mRNA maduros monocistrónicos por reações de trans splicing e poliadenilação. À exceção dos genes de VSG, não existem evidências de regulação transcricional em T. brucei, motivo pelo qual a expressão génica é regulada ao nível pós-transcricional, particularmente por regulação da estabilidade e da tradução do mRNA. Em T. brucei, as estruturas secundárias contribuem para a estabilidade do mRNA e para o recrutamento de proteínas de ligação ao RNA (RBP). Além disso, as RBP podem ligar-se à região 3’UTR dos mRNA para regular a associação do mRNA com a maquinaria de tradução. Os parasitas stumpy forms resultam da diferenciação irreversível dos slender forms. A transcrição e a síntese proteíca estão geralmente reprimidos em stumpy forms, reforçando o seu estado de células quiescentes. Os stumpy forms são importantes para a transmissão para o vector, bem como para a sua sobrevivência neste último. Além disso, os stumpy forms são igualmente importantes para o prolongamento da infecção no hospedeiro. A diferenciação dos slender forms para os stumpy forms está relacionada com o aumento da densidade da população no hospedeiro. Esta diferenciação ocorre por comunicação parasita-parasita, através de um mecanismo de quorum-sensing, em que os slender forms secretam uma molécula, designada Factor de Indução de Stumpy (SIF). A molécula em causa acumula-se e estimula a diferenciação para os stumpy forms com o aumento do número de parasitas. Recentemente, foram identificados vários genes essenciais para a via de quorum-sensing, embora apenas tenham sido identificados reguladores positivos que atuam em diferentes etapas da via de sinalização de SIF, incluindo as fosfatases, as cinases e as proteínas envolvidas na regulação génica, como as RBP. Os RNA longos não codificantes (lncRNA) são RNA com mais de 200 pares de base que não codificam proteínas. Os lncRNA atuam, em diferentes organismos de todos os reinos da vida, como reguladores de expressão génica, através da regulação da transcrição, da estabilidade de mRNA ou da eficiência da tradução, entre outros. Os lncRNA podem atuar in cis ou in trans, assim como em vários compartimentos celulares, nomeadamente no núcleo ou no citoplasma, para regular a expressão génica e a função. Recentemente, foram identificados, em T. brucei, 946 lncRNA, dos quais 567 foram identificados em apenas um estadio do ciclo de vida do parasita, sugerindo, assim, a existência de lncRNA específicos de um estadio. O objetivo desta tese é identificar e caracterizar o papel dos lncRNA na diferenciação dos slender forms para stumpy forms. Para estudar a diferenciação para os stumpy forms, é necessário estabelecer uma linha celular que os assinale. Para tal, foram criados parasitas que expressam GFP especificamente em stumpy forms, devido ao 3’UTR de PAD1, uma proteína marcadora de stumpy forms, cujo 3’UTR permite a expressão génica específica em stumpy forms. Esta linha celular, designada GP1, foi caracterizada usando dois métodos para a formação de stumpy forms in vitro: meio complementado com metilcelulose e meio complementado com pCPT-cAMP, sendo o número de células na fase G1 foi relacionado com o número de células que expressam GFP. Os parasitas cultivados em meio com metilcelulose e/ou com pCPT-cAMP no final de dois ou três dias apresentam uma acumulação de células na fase G1, característica dos stumpy forms. A linha celular GP1 apenas expressa GFP quando a diferenciação dos stumpy forms é induzida, quer in vitro (meio complementado com metilcelulose e/ou pCPT-cAMP) quer in vivo (sangue recolhido seis dias após a infeção, quando a maioria dos parasitas são stumpy forms). Tal facto confirma que a GP1 é uma linha celular marcadora de stumpy forms que pode ser usada para estudar a diferenciação destes. Para selecionar lncRNA potencialmente envolvidos na formação dos stumpy forms, selecionámos lncRNA a jusante e a montante de nove genes essenciais para a formação de stumpy forms, que apresentaram resistência ao SIF in vivo. Assim, propomos que estes lncRNA regulam a expressão e/ou função dos genes essenciais para a formação de stumpy forms, identificando quatro lncRNA localizados imediatamente a jusante ou a montante de três dos nove genes essenciais para formação de stumpy forms. O lncRNA5388 e o lncRNA5389 estão localizados a montante da família de genes NEK, enquanto o lncRNA5837 está localizado a jusante da família de genes RBP7. Por último, o lncRNA6099 está localizado a jusante do gene YAK. Para caracterizar os lncRNA na diferenciação dos stumpy forms, os lncRNA foram quantificados durante a formação de stumpy forms in vitro. Os níveis de transcritos de lncRNA não apresentaram alterações significativas durante a diferenciação para stumpy forms. Para testar a possibilidade de uma função dos lncRNA selecionados ao nível da formação de stumpy forms, determinámos o fenótipo na diferenciação para stumpy forms causado pela depleção ou sobre-expressão dos lncRNA. Contudo, as experiências apresentaram grande variabilidade e inconsistência, tornando-se difícil interpretar e concluir a função dos lncRNA na diferenciação dos stumpy forms. Assim, a continuação do estudo incidiu apenas no lncRNA5837, visto que é o lncRNA localizado a jusante de genes essenciais para a diferenciação dos stumpy forms, assim como para a regulação génica, a família génica RBP7. Além disso, este lncRNA apresenta um perfil de expressão semelhante ao RBP7 durante a diferenciação para stumpy forms. Durante a diferenciação in vitro para stumpy forms, a sobre-expressão de lncRNA5837, tal como a sobre-expressão de RBP7, resultou no aumento de células que expressam GFP, sugerindo isso que há promoção da diferenciação de stumpy forms. Por outo lado, a depleção de lncRNA5837, tal como a depleção de PP1, levou a que menos parasitas se diferenciarem para stumpy forms. Em condições que impedem a formação de stumpy forms, a sobre-expressão de lncRNA5837 é suficiente para induzir os slender forms a se diferenciarem em stumpy forms. Estes resultados são consistentes com o facto de a sobreexpressão de lncRNA5837 levar a uma diminuição da taxa de crescimento dos parasitas, característico da formação de stumpy forms, parasitas em fase G1. A localização celular do lncRNA5837 foi determinada usando RNA FISH. O lncRNA5837 está localizado no núcleo de T. brucei. Em slender forms, é possível observar diversos sinais de lncRNA5837 no núcleo, um sinal mais intenso no nucléolo e um sinal (por vezes, dois) no nucleoplasma. No entanto, os stumpy forms apresentam apenas lncRNA5837 no nucléolo, ainda que aparentemente mais intenso. Em suma, estes resultados sugerem que o lncRNA5837 atua na diferenciação para stumpy forms, através da sua função expressa no nucléolo de T. brucei.Trypanosoma brucei (T. brucei) is the parasite that causes African Human Trypanosomiasis (HAT), also known as sleeping sickness. During its complex life cycle, the parasite alternates between two different hosts, the insect vector and the mammalian host. To adapt and survive in these different environments, the parasite undergoes multiple developmental changes that require coordinated alterations in gene expression. In T. brucei, transcription control of protein-coding genes is scarce and most gene regulation depends on a post-transcriptional regulation. Slender-to-stumpy transition is triggered by an unknown stumpy induction factor (SIF) molecule, which parasites released via quorum-sensing mechanism. Recently, positive regulators of the quorum-sensing pathway have been identified in T. brucei, including an essential protein phosphate 1 (PP1) and stumpy-promoting RNA binding protein (RBP7). Long non-coding RNAs (lncRNAs) are RNAs with more than 200bp that do not encode for protein. In many organisms, lncRNA play important roles in gene regulation, including at post-transcriptional level. Although, our laboratory has recently revealed existence of 946 lncRNA genes in the T. brucei genome, yet any function has been found. We hypothesized lncRNA to control and coordinate gene expression during stumpy formation in T. brucei. The aim of my thesis was to identify lncRNAs that regulate the slender-to-stumpy transition. To that end, we established a reporter cell line, an in vitro culture condition and a gain- and loss-of-function approach to study the function of T. brucei lncRNAs in stumpy differentation. We performed a bioinformatic analysis and selected four lncRNAs based on their genomic location, postulating these lncRNAs to regulate stumpy formation by modulating the expression of their nearby stumpy essential genes. After performing a phenotypic screen for stumpy formation and more detailed experiments, we identified one lncRNA that regulate the slender to stumpy transition of T. brucei. Indeed, while the overexpression of lncRNA5837 promotes stumpy formation, its depletion conversely prevents slender to stumpy transition. Interestingly, the overexpression of lncRNA5837 induces stumpy formation even in absence of external stimulus that promotes parasite differentiation. As a consequence, we identified a new positive regulator of stumpy differentiation in T. brucei. Finally, using RNA FISH experiment, we observed that lncRNA5837 localized mainly in the nucleus of T. brucei. Strikingly, the slender to stumpy transition is associated with a relocalization of lncRNA5837 from the nucleoplasm into the nucleolus of stumpy forms. Altogether, these results suggest that lncRNA5837 regulate the slender-to-stumpy transition through its function inside the nucleolus. In this project, we identify and characterize the first function of a lncRNA in human deadly parasite, T. brucei. Indeed, the lncRNA5837 regulates the parasite differentiation from slender to stumpy forms, which is key process for transmission and infectivity of T. brucei parasite.Figueiredo, Luísa MirandaSilva, Jorge Marques daRepositório da Universidade de LisboaBento, Fábio Pereira2018-11-30T01:30:11Z201520152015-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/22475TID:201065363enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:09:44Zoai:repositorio.ul.pt:10451/22475Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:40:04.656284Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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