Development of new cellular models for step-by-step analysis of Astrogliogenic pathways
| Autor(a) principal: | |
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| Data de Publicação: | 2015 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/22579 |
Resumo: | Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015 |
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Development of new cellular models for step-by-step analysis of Astrogliogenic pathwaysvia JAK/STATgp130STAT3astrócitosistema BiFCTeses de mestrado - 2015Departamento de Biologia vegetalTese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015The Janus kinase/signal transducers and activators of transcription (JAK/STAT) pathway is an evolutionarily conserved mechanism for signalling transduction and involves four steps regulated by protein-protein interactions. Cytokines bind to the common receptor glycoprotein 130 (gp130) to activate JAKs, which then phosphorylate STATs leading to its dimerization and translocation to the nucleus to induce target genes. The activation of this pathway is essential for astroglia production during brain development and upon central nervous system (CNS) damage. Astrocytes are crucial to neuronal survival and determine the ability of the CNS to repair damage and regenerate. Multiple brain insults elicit a reactive response from astrocytes called astrogliosis, which can impair axonal regeneration and the reestablishment of the neural circuits. Due to the pleiotropic effects of the JAK/STAT pathway several attempts have been made to target this signalling pathway. However, further investigation on protein interactions and dynamics are required for an efficient determination of molecular targets. In this regard, bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays offer a direct method to identify potential modulators of protein interactions. In this study, we developed two Venus-based BiFC systems to screen for modulators of key protein-protein interactions in the JAK/STAT pathway, a gp130-Venus and a Venus-STAT3 BiFC system. Both systems worked in living cells and displayed a similar behaviour to endogenous proteins sustaining novel information regarding the dimerization of these proteins. The Venus-STAT3 BiFC system was further validated by a specific inhibitor of STAT3. These results show the potential of the BiFC systems as tools for drug and genetic screenings, as well as step-by-step analysis of the JAK/STAT pathway in diverse biological contexts.A via de sinalização JAK/STAT é um mecanismo de transdução de sinal conservado na evolução, que envolve quatro etapas de fosforilação e a formação de vários complexos proteicos. As citocinas da família da interleucina 6 ligam-se à cadeia comum do receptor composta pela glicoproteína 130 (gp130), induzindo uma alteração de conformação que ativa as JAKs, construtivamente associadas a estes. Por sua vez, as JAKs fosforilam resíduos de tirosina específicos nos recetores que permitem recrutar proteínas, como o fator de transcrição STAT3. As JAKs fosforilam o STAT3 em resíduos específicos e estes dímeros ativados migram para o núcleo para induzir a transcrição de genes específicos. A fosforilação do STAT3 pelas JAKs sempre foi considerada o processo pelo qual estes fatores de transcrição dimerizam, migram para o núcleo e ligam-se ao DNA. No entanto, estudos recentes demonstram que esta proteína existe como dímeros estáveis a priori e estes são continuamente transportados entre o citoplasma e o núcleo. A ativação deste mecanismo de transdução de sinal é essencial para a produção de astrócitos durante o desenvolvimento do cérebro e em alturas de dano no sistema nervoso central. Os astrócitos são extremamente importantes para a sobrevivência dos neurónios e determinam a capacidade de o sistema nervoso central reparar danos e de se regenerar. Existem múltiplos estímulos negativos que podem gerar uma resposta reativa dos astrócitos, denominada astrogliose, que é mediada pela via JAK/STAT. Quando o grau de lesão é severo os astrócitos formam a cicatriz glial, que constitui uma barreira entre o microambiente lesado e o parênquima saudável. Esta barreira limita a extensão do dano e inflamação provenientes do estímulo patológico, protegendo as células neuronais. No entanto, esta resposta imediatamente protetora pode promover doenças e inibir a regeneração do sistema nervoso central se o estimulo patológico persistir e a astrogliose for incapaz de o resolver. A via JAK/STAT condiciona inúmeras respostas biológicas envolvidas no ciclo celular, diferenciação e migração celular e apoptose. Devido ao seu largo espectro de ação, esta via está envolvida em processos fisiológicos fundamentais, como por exemplo, o desenvolvimento e a hematopoiese. A sua associação a diversas patologias é inerente às suas funções, e estas incluem inflamação crónica, doenças autoimunes, desordens neurodegenerativas e vários tipos de cancro. A ativação constitutiva do fator de transcrição STAT3 está associada a muitas destas patologias tornando esta via num alvo terapêutico promissor. No entanto, é necessário um maior conhecimento relativamente às dinâmicas intervenientes em interações proteicas subjacentes a este mecanismo, de forma a determinar mais eficientemente possíveis alvos moleculares e os seus moduladores. A complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) é uma técnica que permite visualizar interações proteicas em células vivas. Esta técnica baseia-se na fusão de fragmentos complementares de uma proteína fluorescente com as proteínas de interesse. Quando as proteínas de interesse interagem a proteína repórter é reconstituída e emite um sinal fluorescente proporcional ao número de dímeros formados. Este sinal pode ser analisado, quantitativamente e qualitativamente, utilizando métodos convencionais como a citometria de fluxo e a microscopia de fluorescência. O sistema BiFC também permite uma análise direta para identificar moduladores promissores de interações protéicas. Aplicando este sistema ao estudo da via JAK/STAT, teremos uma maior compreensão sobre as complexas interações protéicas que controlam a astrogliose, promovendo a regeneração do sistema nervoso central. No presente estudo foram desenvolvidos dois sistemas de BiFC baseados na proteína fluorescente Venus, de forma a avaliar moduladores na interação de proteínas cruciais na via JAK/STAT. Estes sistemas, gp130-Venus e Venus-STAT3, foram criados por clonagem molecular a partir de outros plasmídeos. Posteriormente foram testados em células animais e analisados por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência de forma a avaliar a sua funcionalidade, eficiência e comportamento. Tanto o sistema gp130-Venus como o Venus-STAT3, funcionaram em células vivas, tendo o primeiro baixos níveis de fluorescência, enquanto que o segundo demonstrou uma eficiência total superior. O comportamento de ambos os sistemas foi similar às proteínas endógenas, confirmando as investigações recentes referentes ao estado de dimerização destas proteínas na ausência de estímulos. O Venus-STAT3 produziu um maior nível de fluorescência e portanto foi o sistema estudado com mais profundidade. Para aferir a aplicabilidade do sistema molecular desenvolvido no estudo de interações de proteína, estudámos um dos plasmídeos do sistema Venus-STAT3 em combinação com outros plasmídeos que continham a metade complementar da proteína Venus. Os plasmídeos analisados eram constituídos por diversas proteínas envolvidas em doenças neurodegenerativas como: huntingtin, tau, synuclein, DJ-1 e GFAP, e tanto o factor de transcrição p53 como o seu regulador, mdm2. O sistema Venus-STAT3 também foi investigado em células animais após estimulação com citocinas, voltando a verificar-se um comportamento semelhante ao endógeno. O sistema Venus-STAT3 confere informação direta sobre a dimerização de STAT3. Para provar o seu potencial como ferramenta para a descoberta de novos moduladores desta interação, foi testado com um inibidor específico de dimerização recentemente desenvolvido pelo grupo de investigação da Dr. Rita Delgado. O tratamento com este inibidor reduziu a fluorescência gerada pela interação dos dímeros STAT3, voltando-se a validar este sistema. Os resultados apresentados demonstram o potencial destes sistemas BiFC a dois níveis: 1) como ferramentas na análise de moduladores farmacológicos e genéticos, e 2) na dissecção dos intervenientes da via JAK/STAT em diversos contextos biológicos. Estas ferramentas contribuem para um maior conhecimento das dinâmicas das interações proteicas envolvidas nesta cascada de sinalização, que mesmo parecendo simples se torna complexa quando analisada em conjunto com outras vias de sinalização.Herrera, FedericoCarvalho, Margarida Henriques da Gama, 1972-Repositório da Universidade de LisboaRocha, Ana Catarina Maia2016-02-04T10:08:21Z201520152015-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/22579TID:201068150enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:09:54Zoai:repositorio.ul.pt:10451/22579Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:40:08.645669Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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