Validação de genes alvo da via Rac1/PAK1-BCL6/STAT5 envolvidos na progressão tumoral

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Abrantes, Leonor Bárbara Freira
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.18/5724
Resumo: Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2016
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spelling Validação de genes alvo da via Rac1/PAK1-BCL6/STAT5 envolvidos na progressão tumoralCancro ColorretalRac1/PAK1BCL6/STAT5ChIP-seqResposta e Reparação de Danos no DNAVias de Transdução de Sinal e Patologias AssociadasDissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2016Defendida em janeiro de 2017Trabalho desenvolvido no INSA no grupo de oncobiologia e vias de sinalização da UID do DGH sob a orientação formal dos investigadores que colaboram nessa equipa.O cancro colorretal é um dos tipos de cancro com maior incidência a nível mundial e também dos mais mortíferos, sendo o seu prognóstico tanto mais limitado quanto mais avançado for o estado da doença. A GTPase Rac1 encontra-se sobre-expressa em vários tipos de carcinoma, nomeadamente colorretal e a desregulação da sua sinalização celular tem sido associada à transformação maligna. Em particular, o eixo de sinalização Rac1/PAK1 encontra-se alterado em cerca de 60% dos tumores sólidos, estando esta alteração associada a tumores mais agressivos e invasivos, com prognósticos clínicos mais desfavoráveis, consequentes, muitas vezes, do desenvolvimento de resistência à quimioterapia. Para além disto, Rac1/PAK1 é também responsável pela ativação de várias vias de sinalização que conduzem à regulação da expressão génica, facto que tem adquirido cada vez mais destaque no estudo da progressão tumoral. O laboratório de acolhimento descreveu, em células de carcinoma colorretal, uma nova via de sinalização em que a ativação de Rac1/PAK1 promove um switch transcricional entre o repressor BCL6 e o ativador STAT5, levando a um aumento da expressão génica. Assim, de forma a identificar todos os locais do genoma nos quais a expressão génica poderia ser modulada por esta via, o grupo de investigação utilizou uma abordagem inovadora de análise de dados de ChIP-seq, explorando a seletividade do switch transcricional, BCL6/STAT5. No presente estudo pretendeu-se validar experimentalmente esta nova abordagem de análise de dados de ChIP-seq, procurando, entre os múltiplos “hits” encontrados, um conjunto de genes cuja modulação da expressão por esta via pudesse elucidar algumas das consequências pro-oncogénicas da sobre-ativação de Rac1 e PAK1 observada em tumores agressivos com mau prognóstico. Os nossos resultados identificaram 2402 genes que respondiam ao switch BCL6/STAT5 aquando da estimulação da via Rac1/PAK. Destes, selecionaram-se para validação experimental um conjunto de 15 genes, para os quais os picos detetados resumiam as características da totalidade dos picos identificados no que respeita a parâmetros como dimensão, amplitude, localização relativa ao respetivo gene, entre outros. Como era esperado, com base em estudos prévios, a variação na expressão dos genes identificados, em resposta à manipulação do estado de ativação da via Rac1/PAK1 é ligeira, não ultrapassando três vezes os valores basais. Curiosamente, alguns destes genes exibiam uma diminuição dos níveis de expressão aquando da ativação da via Rac1/PAK1 e o comportamento contrário na sua inibição. Uma análise mais detalhada das sequências delimitadas pelos picos correspondentes, permitiu identificar dois sub-motivos distintos para os genes que respondiam de forma positiva e negativa à ativação da via Rac1/PAK1, dentro do motivo consensus geral de ligação ao DNA dos fatores BCL6 e STAT5. Em paralelo, realizou-se uma análise de agrupamento funcional, tendo-se observado um enriquecimento dentro da lista de genes identificados de genes envolvidos na resposta e reparação de danos no DNA. Os picos correspondentes a estes genes continham o sub-domínio de resposta positiva à estimulação da via Rac1/PAK1 e a análise funcional da sua expressão demonstrou que os níveis de todos eles aumentavam em resposta à ativação da via e diminuíam aquando da inibição da via. A avaliação do impacto fisiológico da ativação destes genes em células de carcinoma colorretal (DLD1) pelo ensaio do cometa, aquando da ativação da via Rac1/PAK1, revelou que esta via confere uma proteção parcial aos danos induzidos pelo tratamento com o agente alquilante sulfonato de etil-metano (EMS), acelerando o processo de reparação dos mesmos. De notar é o facto de que a inibição desta via com o inibidor seletivo de Rac1, EHT1846, bloqueia significativamente a reparação dos danos genómicos, promovendo mesmo o seu agravamento. Este trabalho veio demonstrar que a nova estratégia de análise de ChIP-seq permite a identificação de pequenas variações transcricionais como a que advém da resposta transcricional ao switch BCL6/STAT5, modulada pela via Rac1/PAK1. Revelou, ainda, o papel da via de sinalização Rac1/PAK1-BCL6/STAT5 na resposta e reparação de danos no DNA, sugerindo que a sua inibição farmacológica poderá ter aplicação terapêutica no cancro, nomeadamente na potenciação dos efeitos de determinados agentes quimioterápicos com efeitos genotóxicos.Colorectal cancer is one of the most prevalent types of cancer worldwide and also one of the most deadly malignancies, with its prognosis being poorer the more advanced the state of the disease. The GTPase Rac1 is overexpressed in several types of carcinoma, namely in colorectal cancers, and the dysregulation of its cellular signaling has been tightly associated with malignant transformation. In particular, the Rac1/PAK1 signaling axis is altered in about 60% of solid tumors, this alteration being associated with more aggressive and invasive tumors, with more unfavorable clinical prognosis, often resulting from the development of resistance to chemotherapy. In addition, Rac1/PAK1 is also responsible for the activation of several signaling pathways that lead to the regulation of gene expression, an aspect that has become increasingly prominent in the study of tumor progression. The host laboratory described, in colorectal carcinoma cells, a new signaling pathway in which activation of the Rac1/PAK1 pathway promotes a transcriptional switch between the BCL6 repressor and the STAT5 activator, leading to increased gene expression. Thus, in order to identify all sites in the genome in which gene expression could be modulated by this pathway, the research group used an innovative ChIP-seq data analysis approach, exploring the selectivity of the transcriptional switch, BCL6/STAT5. In the present study, we aimed to experimentally validate this new approach of ChIP-seq data analysis, searching among the multiple hits identified for a set of genes for which the modulation of their expression by this pathway could elucidate some of the prooncogenic consequences of the Rac1/PAK1 over-activation observed in aggressive tumors with poor prognosis. Our results identified 2402 genes responding to the BCL6/STAT5 switch upon stimulation of the Rac1/PAK pathway. From these, a set of 15 genes were selected for experimental validation, since their corresponding ChIP-seq peaks summarized the characteristics of overall identified peaks with respect to parameters such as size, amplitude, location relative to the respective gene, among others. As expected, based on previous studies, the variation in expression levels of the selected genes was small in response to the manipulation of the Rac1/PAK1 pathway activity, not exceeding three times the baseline values. Interestingly, some of these genes exhibited a decrease in expression upon activation of the pathway and the opposite behavior in its inhibition. A more detailed analysis of the sequences delimited by the corresponding peaks allowed to identify two distinct DNA-binding sub-motifs for the genes that responded positively and negatively to the activation of the Rac1/PAK1 pathway, within the general DNA binding consensus factor for BCL6 and STAT5 factors. In parallel, a functional clustering analysis was performed, and enrichment in genes involved in DNA damage response and repair was observed within the identified 2402 gene list. Peaks corresponding to these genes contained the subdomain of positive response to Rac1/PAK1 pathway stimulation and the functional analysis of 4 of these for their expression levels demonstrated that all increased in response to Rac1/PAK1 pathway activation while inhibition of the pathway led to a decrease in their expression. The evaluation of the physiological impact of the activation of these genes in colorectal carcinoma cells (DLD1) by the comet assay, upon activation of the Rac1/PAK1 pathway, has shown that this pathway provides partial protection against damage induced by treatment with alkylating agents such as EMS, accelerating the process of DNA damage repair. Of note is the fact that inhibition of this pathway with the selective Rac1 inhibitor, EHT1846, significantly blocks repair of genomic damage, even increasing its severity. This work demonstrated that the new strategy for ChIP-seq data analysis allows the identification of small transcriptional variations such as that derived from the transcriptional response to the BCL6/STAT5 switch, modulated by the Rac1/PAK1 pathway. It also revealed a role of the Rac1/PAK1-BCL6/STAT5 pathway in the response to DNA damage and repair, suggesting that its pharmacological inhibition may have therapeutic application in cancer, namely in potentiating the effects of chemotherapeutic agents with genotoxic effects.Matos, Paulo Henrique Carrasquinho deBarros, PatríciaRepositório Científico do Instituto Nacional de SaúdeAbrantes, Leonor Bárbara Freira2019-02-07T15:22:23Z20162016-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.18/5724porhttp://repositorio.ul.pt/handle/10451/27408info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-20T15:40:54Zoai:repositorio.insa.pt:10400.18/5724Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T18:40:11.524918Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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