Directly converted astrocytes from human Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) patients exacerbate microglia activation

• Autor(a) principal: PREZADO, Laura Tobias
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/123961
• topic: Ciências biomédicas; Biologia molecular; Esclerose lateral amiotrófica;; Reatividade microglial; Linha celular microglial CHME3; Secretoma de astrócitos; Células percursoras neurais induzidas; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa, que frequentemente termina na morte do paciente 3 a 5 anos após o aparecimento dos primeiros sintomas. Esta doença é caracterizada pela disfunção dos neurónios motores (NMs) do córtex e da medula espinhal (ME), contudo, a reatividade de células gliais, incluindo a microglia e os astrócitos, também têm um papel importante. Os efeitos prejudiciais dos astrócitos nos NMs foram amplamente relatados na ELA, mas pouca informação existe sobre os seus efeitos na microglia. Estudos recentes do nosso grupo indicaram que astrócitos corticais obtidos de ratinhos transgénicos com a mutação G93A no gene superóxido dismutase 1 (mSOD1) produzem um secretoma que ativa as células microgliais, sugerindo que astrócitos reativos determinam a reatividade destas células em modelos experimentais mSOD1. Contudo, não existem dados sobre o papel prejudicial dos astrócitos na microglia quando estas células são derivadas de pacientes, especialmente na ELA não familiar ou esporádica (eELA). Nesta tese pretendemos avaliar como o secretoma de astrócitos de um paciente com eELA afeta o perfil inflamatório de microglia, na ausência e na presença de um estímulo inflamatório, como o IFNγ. Os astrócitos foram diretamente convertidos de fibroblastos de um doente com eELA e de um individuo saudável. Para tal, os fibroblastos foram inicialmente convertidos em células percursoras neurais induzidas (iNPCs) e depois diferenciados em astrócitos induzidos (iAST) durante 7 dias. Após este período, recolheram-se os secretomas dos iAST eELA/controlo saudável, que foram incubados na linha celular microglial CHME3 por 24 horas. O mesmo foi feito em paralelo, após ativação da microglia por 24 horas com IFNγ. No final, avaliaram-se as alterações morfológicas da microglia, a atividade lisossomal e mitocondrial, a expressão génica das citocinas e outros marcadores de reatividade, como a Arginase 1 e a iNOS. Observámos que o secretoma dos iAST eELA não afetava consideravelmente o perfil reativo/inflamatório da microglia em comparação com o secretoma derivado de iAST saudáveis, excetuando a expressão de IL-6 e a atividade mitocondrial, que mostraram estar comprometidas. Na microglia ativada com IFNγ, verificámos um aumento da expressão dos marcadores pró- e anti-inflamatórios, em conjunto com aumento da morfologia ameboide, sugestiva de um fenótipo heterogéneo e mais reativo. Os resultados obtidos após a adição dos secretomas à microglia ativada com o IFNγ indicaram haver sobre-ativação microglial, caracterizada pelo aumento do número de células ameboides comparativamente com as células expostas ao secretoma dos iAST saudáveis, bem como aumento da expressão génica de TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, Arginase1 e iNOS. O secretoma dos iAST eELA também elevou a atividade lisossomal e mitocondrial na microglia estimulada com IFNγ, relativamente ao secretoma dos iAST controlo. Em suma, os nossos resultados indicam que existe indução da ativação da microglia na presença de secretoma derivado dos iAST do doente eELA, nomeadamente em ambiente inflamatório. Igualmente validam o uso dos iAST derivados de iNPCs como um modelo experimental vantajoso no estudo da eELA, dado que tal não é possível com os modelos animais transgénicos, o que pode proporcionar um tratamento mais personalizado e dirigido a alvos específicos.