Optimization of curcuminoids production in different hosts

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Gomes, Daniela Filipa Correia
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1822/80366
Resumo: Dissertação de mestrado em Genética Molecular
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spelling Optimization of curcuminoids production in different hostsOtimização da produção de curcuminóides em diferentes hospedeirosCRISPR-Cas9CurcuminóidesEscherichia coliSaccharomyces cerevisiaeVia biossintéticaBiosynthetic pathwayCurcuminoidsCiências Naturais::Ciências BiológicasDissertação de mestrado em Genética MolecularOs curcuminóides são metabolitos secundários de plantas com várias propriedades terapêuticas identificadas. Devido às quantidades residuais sintetizadas pela planta Curcuma longa, é importante estudar a produção heteróloga destes compostos em diferentes hospedeiros. A produção destes compostos foi já demonstrada em Escherichia coli. Contudo, o uso de hospedeiros alternativos deve ser avaliado. Saccharomyces cerevisiae foi selecionada como hospedeira para produzir curcuminóides devido à sua capacidade de fazer modificações pós-tradução e por apresentar compartimentos intracelulares semelhantes aos das plantas. Este trabalho teve como objetivo projetar, construir e validar uma via biossintética para produzir curcuminóides em E. coli e em S. cerevisiae, de modo a otimizar a produção destes compostos. Em E. coli foram produzidos curcuminóides através de uma estratégia de monocultura. A produção total de curcuminóides aumentou para 18,9 µM (6,8 mg/L) face ao anteriormente reportado. Para além disso, o uso de co-culturas foi avaliado para melhorar a produção destes compostos uma vez que permite reduzir a carga metabólica das células. Nestes ensaios, uma estirpe foi usada para converter tirosina em ácidos hidroxicinâmicos e outra estirpe converteu estes ácidos em curcuminóides. As produções obtidas com estas estirpes foram testadas separadamente. A partir da tirosina, a produção mais alta de ácido ferúlico foi 1,3 mM (258,3 mg/L). Relativamente à segunda parte da via, foi possível obter a produção mais alta de curcumina reportada até agora (1529,6 µM – 563,5 mg/L). Na estratégia da co-cultura, com o objetivo de determinar o rácio das estirpes ao longo do tempo através do método de seleção azul-branco, foi utilizado o método Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats – associated caspase 9 endonuclease (CRISPR-Cas9) para, numa das estirpes de E. coli, interromper o gene lacZ. Este rácio foi também determinado utilizando placas que continham ácido ferúlico. A produção mais elevada alcançada de curcuminóides foi 125,8 µM (41,5 mg/L). Esta produção foi obtida utilizando uma estratégia de co-cultura e representa um aumento de 6,6 vezes na produção de curcuminóides comparando com a produção obtida utilizando a estratégia de monocultura. Em S. cerevisiae, foi possível produzir curcumina utilizando plasmídeos epissomais. Devido à instabilidade e variação no número de cópias, foi construída uma via biossintética para ser integrada no genoma de levedura. A via foi integrada nos locais delta do retrotransposão Ty através de uma estratégia baseada em CRISPR-Cas9. A estirpe construída produziu 7,1 nM (2,6 ng/L) de curcumina. Tendo em conta os níveis de produção obtidos, é essencial fazer futuras otimizações para que se possa perspetivar a produção destes compostos à escala industrial.Curcuminoids are plant secondary metabolites with recognized therapeutic properties. Due to the low amounts synthetized by Curcuma longa, it is important to explore its production in heterologous hosts. The production of these compounds have been demonstrated in Escherichia coli. Therefore, the use of alternative hosts must be evaluated. Saccharomyces cerevisiae was selected as a potential host due to its capacity to perform post-translational modifications and because it presents intracellular compartments like those in plant cells. This work aimed to design, construct and validate a biosynthetic pathway to produce curcuminoids in E. coli and S. cerevisiae towards an improvement in the production of these compounds. In E. coli, curcuminoids were produced using a mono-culture strategy. The total production of curcuminoids have increased to 18.9 µM (6.8 mg/L). Moreover, a co-culture was evaluated to improve these productions by reducing the metabolic burden. In these assays, one strain was able to convert tyrosine into hydroxycinnamic acids, while the other strain converted the hydroxycinnamic acids to curcuminoids. The production by these strains was tested separately. Starting from tyrosine, it was obtained the highest production of ferulic acid (1.3 mM – 258.3 mg/L). Relatively to the second module of the pathway, it was obtained the highest production of curcumin reported so far (1529.6 µM – 563.5 mg/L). Using Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats – associated caspase 9 endonuclease (CRISPR-Cas9), lacZ gene was disrupted in one of the E. colistrainsto determine the strain to-strain ratio overtime by blue-white screening method. Plates containing ferulic acid were also used to determine this ratio. The highest production achieved using a co-culture strategy was 125.8 µM (41.5 mg/L), representing a 6.6-fold improvement in the production of curcuminoids comparing to the mono culture production. This is the highest production of curcuminoids from tyrosine reported so far. In S. cerevisiae, the production of curcumin was achieved using episomal plasmids. However, due to these plasmids instability and variation in copy number, the biosynthetic pathway was constructed towards its integration in the genome. The biosynthetic pathway was successfully integrated into Ty retrotransposons delta sites using a CRISPR-Cas9 based strategy and this strain was able to produce 7.1 nM (2.6 ng/L) of curcumin. Considering the production levels herein achieved using both hosts, further optimizations are needed if the industrial production of these compounds is envisaged.Rodrigues, Joana Lúcia Lima CorreiaCôrte-Real, ManuelaUniversidade do MinhoGomes, Daniela Filipa Correia2019-11-072019-11-07T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttps://hdl.handle.net/1822/80366eng202471993info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-12-09T01:20:57Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/80366Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T19:41:12.533939Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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