Engineering Saccharomyces cerevisiae for the production of mannosylglycerate: a yeast model for assessing its application in the protein stabilization
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| Data de Publicação: | 2010 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/2464 |
Resumo: | Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010 |
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Engineering Saccharomyces cerevisiae for the production of mannosylglycerate: a yeast model for assessing its application in the protein stabilizationMicrobiologiaManosilgliceratoLevedurasBiotecnologiaTeses de mestrado - 2010Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Mannosylglycerate (MG) is an osmolyte widespread in microorganisms adapted to hot environments. The effect of MG on the protection of model proteins against heat-induced denaturation and aggregation has been amply demonstrated in vitro. These characteristics make MG a valuable compound in biotechnological applications. However, the practical application of MG is hampered by the high production cost. In this work, we engineered Saccharomyces cerevisiae for the production of MG. Two strains (VSY71 and CEN.PK2) and several carbon sources were examined to optimize the production of MG. Using glucose as carbon source, the strain VSY71 accumulated 90 μmol MG/g of dry mass, an increase of 2-fold compared with strain CEN.PK2. The effect of several carbon sources (sucrose, mannose, galactose and raffinose) on MG production by strain VSY71 was also investigated. Synthesis of MG (28.1 μmol/g of dry mass) was detected with sucrose only. In addition to the biotechnological importance of being a MG producer, this strain can serve as a platform to assess protein stabilization by osmolytes in vivo. Therefore, we used it to evaluate the effect of MG on the aggregating-prone protein, α-synuclein (α-Syn). For that, the S. cerevisiae strain VSY72, harboring two copies of α-Syn-EGFP integrated in the genome, was engineered to synthesize MG. As a control, a mutant transformed with the empty MG-plasmid was also constructed. The accumulation of MG (20 μmol/g of dry mass) prior to α-Syn over-production clearly reduced the formation of inclusions of this protein; moreover, the formation of reactive oxygen species induced by α-Syn overproduction decreased in the MG-producing strain. Additionally, when MG accumulation was induced in cells harboring large inclusions of α-Syn there was an effective solubilization of these forms. This work clearly shows that MG inhibits the aggregation of α-Syn and promotes the solubilization of α-Syn inclusions in vivo.Microrganismos adaptados a proliferar optimamente em ambientes com temperatura elevada são designados termófilos ou hipertermófilos, consoante a temperatura óptima de crescimento se situa entre 60oC e 80oC ou acima de 80oC, respectivamente. Estes organismos tem sido isolados a partir de amostras de zonas geotermais, quer terrestres quer marinhas, superficiais ou de profundidade, bem como de ambientes aquecidos artificialmente. Tal como a maioria dos microrganismos halofílicos ou halotolerantes, os microrganismos termofílicos e hipertermofílicos provenientes de ambientes marinhos acumulam compostos orgânicos denominados “solutos compatíveis” para contrabalançar a pressão osmótica exterior. São moléculas de baixa massa molecular, com elevada solubilidade em água e que podem atingir concentrações elevadas no interior das células (da ordem de 1 M) sem interferirem negativamente com as funções celulares. Para alem da sua função na adaptação a flutuações na osmolaridade do meio exterior, alguns destes solutos são preferencialmente acumulados em resposta a temperaturas supra-óptimas. Além disso, os solutos tipicos de (hiper)termófilos são quimicamente diferentes dos que geralmente são encontrados em organismos mesofílicos, nomeadamente no que se refere a carga eléctrica da molécula que é negativa nos primeiros e neutra nos segundos. Este conjunto de observações levou a hipótese de que os solutos compatíveis de (hiper)termófilos desempenhariam um papel relevante na protecção de componentes celulares contra os efeitos desnaturantes provocados por temperaturas elevadas. Manosilglicerato e um dos solutos compatveis mais frequentemente encontrado em microrganismos adaptados a ambientes quentes. Foi identificado inicialmente em Rhodothermus marinus, uma bacteria termofílica isolada de uma nascente geotermal dos Açores, mas posteriormente foi detectado em muitos outros (hiper)termófilos (trabalho da nossa equipa). A maioria dos organismos estudados acumula este soluto em resposta a stress osmótico, no entanto acumulação em resposta a stress térmico tem sido observada em alguns casos. Ensaios in vitro com proteínas modelo mostraram que manosilglicerato actua como estabilizador, exibindo capacidade termoprotectora muito superior a da trealose, um soluto caracteristico de organismos iv mesófilos. Manosilglicerato tem-se revelado um excelente protector da estrutura de proteínas, impedindo a sua desnaturação e subsequente agregação, bem como a perda de actividade no caso de enzimas. Por estas razões, o manosilglicerato tem grande potencialidade de aplicação, nomeadamente na industria cosmética, como hidratante e protector solar, na conservação de vacinas durante armazenamento e transporte, como estabilizador de enzimas em “kits” clínicos e analíticos e na estabilização de proteínas usadas em biosensores. Em particular, manosilglicerato aumenta o tempo de vida de vectores retrovirais e melhora a sensibilidade em metodologias com microgrelhas de DNA. Trata-se portanto de um composto valioso sob o ponto de vista biotecnológico. Contudo, a produção de manosilglicerato e actualmente um processo altamente dispendioso, uma vez que o seu isolamento e realizado a partir da biomassa de um produtor natural, Rhodothermus marinus, que acumula apenas 15 g por kg de biomassa húmida (resultados não publicados). Neste contexto, torna-se premente o desenvolvimento de um produtor industrial de manosilglicerato de modo a conseguir custos de produção competitivos. A estrategia mais promissora envolverá necessariamente a manipulação genética de uma estirpe industrial (nomeadamente, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis) de modo a dotá-la com a capacidade para produzir manosilglicerato em larga escala. Esta tarefa é exequível visto que os genes envolvidos na síntese deste composto são conhecidos. Um dos objectivos do presente trabalho foi melhorar a produção de manosilglicerato usando uma organismo industrial. Para tal seleccionou-se a estirpe S. cerevisiae VSY71 que foi transformada com o plasmídeo (p425::mgsD), contendo o gene que codifica a enzima bifuncional manosil-3-fosfoglicerato sintase/fosfatase da bactéria mesofílica Dehalococcoides ethenogenes. Esta enzima sintetiza manosilglicerato a partir de GDP-manose e 3-fosfoglicerato. Estratégia idêntica tinha sido anteriormente seguida usando como hospedeiro a estirpe CEN.PK2 (Empadinhas et al., 2004), pelo que transformamos CEN.PK2 também com p425::mgsD e usámo-la para fins de comparação de produção. Para optimização da produção de manosilglicerato usou-se S. cerevisiae estirpe VSY71, contendo o plasmídeo para a síntese de manosilglicerato, e testaram-se varias fontes de carbono e varias salinidades no meio de crescimento. Os substratos rafinose, manose e galactose não conduziram a síntese de manosilglicerato, apesar de suportarem crescimento celular ainda que com velocidades de crescimento inferiores as registadas em glucose. Células cultivadas em sucrose acumularam 28 μmol de manosilglicerato por grama de biomassa seca. Produção maxima, 90 μmol de manosilglicerato por grama de biomassa seca, foi observada usando glucose como v fonte de carbono. Este valor é cerca de duas vezes superior à produção de manosilglicerato observada com a estirpe S. cerevisiae CEN.PK2. Os resultados mostram que a produção de manosilglicerato depende em grande medida da estirpe utilizada pelo que há todo um trabalho de rastreio de colecções de S. cerevisiae que será susceptível de conduzir a produções de manosilglicerato consideravelmente superiores. Mesmo assim, vale a pena destacar que a estratégia seguida neste trabalho conduziu a um melhoramento considerável da produção específica em comparação com a estratégia descrita na literatura. Um segundo objectivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de manosilglicerato na estabilização de proteínas in vivo, ou seja, no meio extremamente viscoso e com elevada concentração molecular que constitui o citoplasma celular. O esforco investido neste tópico teve uma dupla finalidade: i) encontrar novas aplicações para manosilglicerato, eventualmente relacionadas com abordagens para prevenir agregação proteica induzida por erros no enrolamento de cadeias polipeptídicas; ii) e obter evidência experimental para apoiar a hipótese de que manosilglicerato exerce de facto um papel protector da estrutura de proteínas in vivo. Para realizar este objectivo usou-se um modelo de levedura para a doenca de Parkinson, no qual o gene codificante da α-Sinucleína humana (fundido com o gene codificante para uma proteína super-fluorescente) foi super-expresso em S. cerevisiae VSY72, onde também foi expresso o gene para a síntese de manosilglicerato. As células recombinantes produziram α-Sinucleína e manosilglicerato, permitindo comparar o efeito da presenca e ausência de manosilglicerato na agregação de α-Sinucleína em ambiente intracelular. α-Sinucleína e uma proteína encontrada apenas no cerebro de mamíferos. Embora a sua função fisiológica seja desconhecida, sabe-se que esta associada a varias doenças neurodegenerativas (doenca de Parkinson entre outras menos comuns) visto ser um dos componentes dos agregados proteicos que caracterizam estas patologias. α-Sinucleína e uma proteína intrinsecamente desenrolada, isto e, a forma nativa não tem estrutura definida. A proteína tem tendência para auto-associação formando em muitos casos estruturas fibrilares, designadas amiloides. Quando produzida na levedura S. cerevisiae, por manipulação genetica, a α-Sinucleína e transportada para a membrana plasmatica onde se ancora. A super-produção desta proteína leva a formação, perto da membrana, de pequenas inclusões citoplasmaticas que aumentam progressivamente de tamanho, originando grandes inclusões, visiveis por microscopia de fluorescência. Neste trabalho, usamos a estirpe VSY72 que contem duas copias do gene da α-Sinucleína integradas no cromossoma e que foi transformada com o plasmídeo que contém o gene que codifica para a síntese do manosilglicerato. Como controlo foi usada a estirpe VSY72 transformada com o plasmídeo vazio. A produção de manosilglicerato e regulada por um promotor constitutivo, enquanto que a produção de α-Sinucleína e controlada por um promotor sensivel a galactose. A acumulação intracelular de manosilglicerato (20 μmol por grama de biomassa seca) reduziu em 3,5 vezes o numero de células com inclusões de α-Sinucleína, em comparação com a estirpe controlo (incapaz de sintetizar manosilglicerato). Estes resultados referem-se a células examinadas dez horas após indução da produção de α-Sinucleína. Tivemos o cuidado de verificar que as duas estirpes apresentam niveis semelhantes de produção de α-Sinucleína (análises por “western blot”). Em paralelo, monitorizaram-se os niveis de especies reactivas de oxigénio induzidas pela produção excessiva de α-Sinucleína. Os resultados mostraram que a presenca de manosilglicerato no citoplasma causou uma diminuição no nivel de espécies reactivas de oxigénio em comparação com o controlo. Por outras palavras, ao prevenir a formação de inclusões de α-Sinucleína, o manosilglicerato diminuiu também o nível de stress oxidativo associado ao processo de super-expres são da proteína, possivelmente promovendo a estabilização de formas nativas de α-Sinucleína, supostamente com menor toxicidade para a célula. Tendo-se demonstrado o efeito inibitório de manosilglicerato na formação de inclusões de α-Sinucleína, pôs-se a questão de saber se este composto teria também efeito ao nível da solubilização de inclusões pré-formadas. Para tal, a produção de α-Sinucleína foi induzida nove horas antes da indução da síntese de manosilglicerato, por permuta de meio contendo galactose para meio fresco contendo glucose como única fonte de carbono. Os resultados obtidos mostraram que o manosilglicerato tem uma acção de chaperona molecular, promovendo a desagregação das inclusões de α-Sinucleína: uma hora apos indução da síntese de manosilglicerato o numero de inclusões visíveis por microscopia de fluorescência era 2,8 vezes inferior ao detectado em células controlo. O efeito do manosilglicerato na prevenção/solubilização de inclusões de α-Sinucleína pode ser atribuido a activação de mecanismos celulares que conduzem a degradação de formas anormais de α-Sinucleína, ou que promovem o seu enrolamento correcto. Alternativamente, o efeito benéfico observado pode resultar de uma interacção directa soluto/proteína que estabilize preferencialmente a estrutura nativa da α-Sinucleína, prevenindo assim a formação de inclusões. Os resultados descritos nesta tese não permitem tirar conclusões definitivas sobre o tipo de mecanismo envolvido, no entanto a observação de efeitos semelhantes em ensaios in vitro monitorizados por microscopia electrónica (resultados de outros membros da equipa) fundamentam a hipotese de que interacções directas manosilglicerato/proteína terão uma contribuição relevante quer in vivo quer in vitro.Santos, HelenaCarolino, M. Manuela, 1954-Repositório da Universidade de LisboaFaria, Cristiana Silva, 1985-2011-02-10T18:59:18Z20102010-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/2464enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:42:50Zoai:repositorio.ul.pt:10451/2464Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:28:49.593618Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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