The control of cardiomyocyte proliferation by Cerl2 protein

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Maria de Fátima Leitão da
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/44271
Resumo: Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019
id RCAP_ad240d8189650db31b29c5815c06f15c
oai_identifier_str oai:repositorio.ul.pt:10451/44271
network_acronym_str RCAP
network_name_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository_id_str 7160
spelling The control of cardiomyocyte proliferation by Cerl2 proteinProliferação de cardiomiócitosCerl2Vias de sinalizaçãoDesenvolvimento coraçãoAssimetria esquerda-direitaCultura in vitroTeses de mestrado - 2019Departamento de Biologia AnimalTese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019O desenvolvimento embrionário tem fascinado cientistas e filósofos desde a primeira descrição de Aristóteles sobre a fertilização e o desenvolvimento embrionário até à descoberta dos diferentes mecanismos genéticos e moleculares da atualidade. A Embriogénese é um mecanismo extremamente complexo que envolve interações temporais e espaciais entre milhares de células e moléculas. Começa com a fecundação de um oócito feminino por um espermatozoide masculino, que gera o zigoto. O zigoto sofre múltiplas divisões e rearranjos espaciais num processo chamado de gastrulação. As diferentes células diferenciam-se e especializam-se em três folhetos embrionários: endoderme, mesoderme e ectoderme. Estes vão sofrer rearranjos – morfogénese; e formar órgãos – organogénese; que eventualmente darão origem a um ser completo com capacidade de se reproduzir. Qualquer mínima falha neste processo pode desencadear uma cadeia de consequências, desde pequenas malformações até, em casos críticos, à inviabilidade do embrião e consequente morte. Os animais apresentam vários tipos de morfologia corporal, devido à formação de órgãos com várias funções e diferente posicionamento durante a embriogénese. Nos vertebrados, o coração é o primeiro órgão a ser formado para poder fornecer oxigénio e nutrientes essenciais ao embrião em desenvolvimento. Para a sua morfogénese, várias vias de sinalização moleculares necessitam de estar intimamente relacionadas entre si. Falhas neste processo levam ao surgimento de doenças cardíacas congénitas. Durante o desenvolvimento embrionário, são vários os mecanismos que determinam o correto posicionamento deste e de todos os outros órgãos através da origem sequencial dos três principais eixos: o Anterior-Posterior (A-P), o Dorso-Ventral (D-V) e o Esquerdo-Direito (E-D). Este último é responsável, entre outras coisas, pelo posicionamento do coração na caixa torácica e pela correta morfologia dos ventrículos e das aurículas. Uma das principais vias de sinalização nesta fase do desenvolvimento, é a do Nodal. Nodal é uma proteína secretada pertencente à superfamília de fatores de crescimento β (TGF-β) que medeia a diferenciação inicial da mesoderme e é fundamental para a formação da linha primitiva e do nó na futura parte posterior do embrião. A formação destas duas estruturas marca o início do desenvolvimento do eixo A-P e D-V. O nó é uma estrutura transiente que tem um papel organizacional na formação do terceiro eixo, o E-D. As células ciliadas deste organizador do nó criam um movimento de rotação unidirecional que provoca o deslocamento de Nodal para o lado esquerdo do nó, onde vai interagir com várias proteínas antagonistas que vão limitar a sua expressão à Placa Lateral Esquerda da Mesoderme (PLEM). Esta expressão assimétrica de Nodal será a primeira quebra na simetria do embrião e levará ao correto posicionamento e formação do primeiro órgão assimétrico, o coração. Qualquer mutação que afete os genes desta cascata de sinalização, poderá levar a defeitos de lateralidade. Com o objetivo de tentar compreender as patologias resultantes de anomalias na lateralidade presentes em humanos, foram desenvolvidos vários estudos e modelos animais, como ratinhos knockout para o gene Cerberus-like 2 (Cerl2). Cerl2 é uma proteína da família Cerberus/Dan conhecida por antagonizar moléculas da família TGF-β/Nodal. Em ratinho, Cerl2 é expresso assimetricamente nas células do lado direito do nó, onde a sua atividade modula o sinal de Nodal, restringindo-o à PLEM. A ausência da sua atividade antagonista causa uma sinalização anormal de Nodal no lado direito que desencadeia uma série de defeitos de lateralidade, tais como situs inversus (inversão da posição dos órgãos) e isomerismo (duplicação dos lados esquerdo ou direito). Um estudo no nosso grupo revelou que aproximadamente 40% dos ratinhos KO para Cerl2 apresentam vários defeitos de assimetria esquerda-direita. A maioria deve-se a problemas cardíacos, tais como falha na orientação do eixo cardíaco (looping randomizado), na formação do septo ventricular e auricular, transposição das grandes artérias e hipertrofia ventricular. Todos estes defeitos levam à inviabilidade do embrião ou morte à nascença. De forma a verificar independentemente qual seria o papel de Cerl2 na formação dos defeitos cardíacos, foram selecionados ratinhos que não apresentavam defeitos de assimetria. Verificou-se então que estes apresentavam um aumento significativo no miocárdio compacto da parede dos ventrículos, bem como uma redução do pico de velocidade da artéria pulmonar e uma diminuição do ritmo cardíaco em relação à população wild-type (WT). O aumento do miocárdio foi associado a uma maior proliferação dos cardiomiócitos devido à ocorrência de a um maior índice mitótico, evidenciado pelo aumento da expressão de uma proteína do ciclo celular. Este aumento verificou-se nos estádios embrionários 13 (E13), e 15 (E15) e pós-nascimento (P0). No entanto, a E15 o aumento foi menor, não sendo considerado estatisticamente significativo. A este aumento de proliferação foram também associados maiores níveis de pSMAD2 e β–catenina nuclear, sugerindo uma ação prolongada da sinalização TGF-β/Nodal e Wnt/β–catenina, das quais são intermediários. Sabe-se que estas vias estão associadas à proliferação de cardiomiócitos durante a cardiogénese e a sua inibição leva à diferenciação dos mesmos. Como tal, propomos que a ausência de Cerl2 desiniba estas vias e cause uma maior proliferação destas células ao longo do desenvolvimento do coração. Para tentarmos desvendar este mecanismo de ação do Cerl2 e verificarmos que a proliferação é independente de outras vias ou células fora do miocárdio compacto do coração, isolámos cardiomiócitos de corações de embriões de ratinhos Cerl2-/- e WT nos estádios E13 e E15. Os cardiomiócitos isolados foram divididos em três placas de cultura para serem fixados a diferentes pontos no tempo: 1, 4 e 7 dias após o respetivo isolamento. Este passo era fundamental pois, se os cardiomiócitos dos ratinhos Cerl2-/- de facto proliferassem mais em cultura em relação aos WT, era importante saber durante quanto tempo o conseguiam fazer e em que quantidade. Para podermos avaliar a taxa de proliferação recorremos à técnica de imunofluorescência. Para tal, usámos um marcador de cardiomiócitos – α-actinina sarcomérica (α-actinin); e um marcador de proliferação - Ki67. A taxa de proliferação foi feita dividindo o número de células que eram positivas para ambos os marcadores (α-Act+Ki67+) pelas que só eram positivas para α-actinin. Verificámos que in vitro, os cardiomiócitos dos ratinhos Cerl2-/- no estádio E13 apresentavam uma percentagem significativamente maior de proliferação do que os WT em todos os dias analisados. A maior diferença encontrada foi de 14.50%, em média, para o primeiro dia em cultura. No estádio E15 verificámos uma diminuição significativa na proliferação em relação ao estádio anterior. Dentro de E15, entre WT e Cerl2 KO verificámos uma diferença bastante significativa no primeiro dia. No entanto, não foram significativas nos restantes dias. Estes resultados estão de acordo com estudos anteriores. Cerl2 é expresso no coração até E13, o que corresponde à fase de maior índice mitótico encontrado. Em E15 os resultados também parecem sugerir haver uma diminuição na proliferação. Esta diminuição também se verifica in vivo, pois um dos picos de proliferação ao longo do desenvolvimento encontra-se entre E12-13. Verificamos que de facto há uma diferença na proliferação entre WT e Cerl2 KO E15 no primeiro dia em cultura, mas que deixa de ser significante nos dias a seguir. Os resultados parecem corroborar a hipótese de que Cerl2 é de facto o regulador das vias de sinalização da proliferação de cardiomiócitos e que a cascada de efeitos resultantes ainda é existente a E13. Estas vias serão possivelmente TGF-β/Nodal e Wnt/β-catenina como reportado anteriormente. A diminuição a E15 poderá ser explicada pela diminuição dos efeitos neste estádio do desenvolvimento que só é suficiente para manter a maior taxa de proliferação em um dia de cultura. De facto, sendo Cerl2 expresso no coração só até E13, é de esperar que outras sinalizações levem à redução dos efeitos das vias de sinalização anteriores. O estudo da proliferação de cardiomiócitos tem vindo a ser cada vez mais fundamental no desenvolvimento de soluções para doenças cardíacas. As doenças cardíacas são das principais causas de morte no mundo. O coração adulto é um órgão com pouca capacidade de regeneração. DAND5 é o homólogo humano de Cerl2 e foi recentemente associado a uma série de defeitos de assimetria em Portugal. Uma das pessoas portadoras de uma variação deste gene possui defeitos cardíacos. Esta descoberta poderá estar relacionada com os processos que levam aos defeitos cardíacos em ratinho. Esperamos que os resultados obtidos possam abrir caminho para possíveis métodos de proliferação de cardiomiócitos para usar em medicina regenerativa e compreensão de doenças congénitas humanas.Cerl2 is a protein of the Cerberus/Dan family known to antagonize molecules of the TGF-β/Nodal fam-ily. In mice, Cerl2 modulates Nodal signaling, contributing to the left-right asymmetry in the lateral mesoderm plate of the developing embryo. Knock-out mice (KO) for Cerl2 show several left-right asymmetry defects that lead to embryonic lethality or death at birth. These mice also show a significant increase of the compact myocardium wall of the left ventricle, even in mice without laterality defects, suggesting that Cerl2 has an important role in the developing heart. This increase is associated with a higher mitotic index and proliferation of cardiomyocytes. These cells show higher levels of pSMAD2 and nuclear β–catenin, suggesting an extended exposure of the TGF-β/Nodal and possibly Wnt/β–catenin signaling. These signaling pathways are associated to cardiomyocytes proliferation and its inhi-bition leads to their differentiation. As such, we propose that the absence of Cerl2 up-regulates these pathways and leads to an increase in cardiomyocyte proliferation in the developing heart. To better understand this Cerl2 mechanism and confirm that the proliferation is regulated in the heart cells, we isolated cardiomyocytes from Cerl2-/- and wild-type (WT) mice at stages E13 and E15. We verified that in culture, E13 cardiomyocytes show a significantly increase in proliferation when compared to WT in all the days analyzed. In stage E15 we also observe a decrease in proliferation compared to the previous stage, but significant differences between both types were only found at one day after culture. These results mirror former studies and demonstrate that the cells regulate their own proliferation. DAND5 is the human homologue of mouse Cerl2 and it has been also recently associated with several body-axis asymmetry defects in Portuguese patients. We hope these results can lead us to future methods of cardiomyocytes proliferation for regenerative medicine and understanding of heart diseases.Belo, José António, 1966-Rodrigues, Maria Gabriela, 1965-Repositório da Universidade de LisboaSilva, Maria de Fátima Leitão da2020-08-27T10:33:07Z201920192019-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/44271TID:202598985enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:45:13Zoai:repositorio.ul.pt:10451/44271Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:56:53.608999Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
dc.title.none.fl_str_mv The control of cardiomyocyte proliferation by Cerl2 protein
title The control of cardiomyocyte proliferation by Cerl2 protein
spellingShingle The control of cardiomyocyte proliferation by Cerl2 protein
Silva, Maria de Fátima Leitão da
Proliferação de cardiomiócitos
Cerl2
Vias de sinalização
Desenvolvimento coração
Assimetria esquerda-direita
Cultura in vitro
Teses de mestrado - 2019
Departamento de Biologia Animal
title_short The control of cardiomyocyte proliferation by Cerl2 protein
title_full The control of cardiomyocyte proliferation by Cerl2 protein
title_fullStr The control of cardiomyocyte proliferation by Cerl2 protein
title_full_unstemmed The control of cardiomyocyte proliferation by Cerl2 protein
title_sort The control of cardiomyocyte proliferation by Cerl2 protein
author Silva, Maria de Fátima Leitão da
author_facet Silva, Maria de Fátima Leitão da
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Belo, José António, 1966-
Rodrigues, Maria Gabriela, 1965-
Repositório da Universidade de Lisboa
dc.contributor.author.fl_str_mv Silva, Maria de Fátima Leitão da
dc.subject.por.fl_str_mv Proliferação de cardiomiócitos
Cerl2
Vias de sinalização
Desenvolvimento coração
Assimetria esquerda-direita
Cultura in vitro
Teses de mestrado - 2019
Departamento de Biologia Animal
topic Proliferação de cardiomiócitos
Cerl2
Vias de sinalização
Desenvolvimento coração
Assimetria esquerda-direita
Cultura in vitro
Teses de mestrado - 2019
Departamento de Biologia Animal
description Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019
publishDate 2019
dc.date.none.fl_str_mv 2019
2019
2019-01-01T00:00:00Z
2020-08-27T10:33:07Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv http://hdl.handle.net/10451/44271
TID:202598985
url http://hdl.handle.net/10451/44271
identifier_str_mv TID:202598985
dc.language.iso.fl_str_mv eng
language eng
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron:RCAAP
instname_str Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron_str RCAAP
institution RCAAP
reponame_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
collection Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository.name.fl_str_mv Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1799134511667085312

Registros relacionados