Modelling degenerative retinal mechanisms in 3D retinal organoids

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Santos, Inês Mariana Abreu Aguiar Paz
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/54799
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
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spelling Modelling degenerative retinal mechanisms in 3D retinal organoidsRetinaParkinson’s Disease3D-organoidsa-synucleinOxidative stressInflammationMitochondrial dysfunctionTeses de mestrado - 2022Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.O olho humano é uma estrutura de importância extrema, associada à aquisição e interpretação de informação visual por meio de deteção luminosa, sendo formado pelo globo ocular e estruturas acessórias dotadas de capacidade de suporte e proteção. O globo ocular é, por sua vez, constituído pela túnica vascular, túnica fibrosa e pela retina, sendo esta última um tecido sensorial e organizado em diferentes camadas celulares com microcircuitos que trabalham em paralelo para decodificar informação visual. A retina humana é composta pelo epitélio pigmentar da retina, com grânulos de melanina que são capazes de absorver a luz que passa pela retina e providenciar uma maior qualidade de visão, e pela neuroretina. Esta última é uma estrutura com várias camadas associadas a cinco tipos celulares principais: células horizontais, bipolares, amácrinas, ganglionares e fotorrecetores, podendo estes ser de dois tipos distintos, cones ou bastonetes. A principal causa de perda de visão e defeitos visuais na espécie humana está diretamente relacionada com doenças da retina associadas à idade como é o caso do glaucoma ou da degenerescência macular em que ocorre perda de função e morte de tipos celulares específicos da retina, em associação com níveis altos de stress oxidativo, inflamação e disfunção mitocondrial. Curiosamente, nos últimos anos, têm sido estabelecidas correlações entre os mecanismos patofisiológicos e características distintivas das doenças da retina associadas à idade quando comparadas com doenças neurodegenerativas como a Doença de Parkinson. Para além de defeitos como uma diminuição da sensibilidade ao contraste espacial, acuidade visual reduzida, e dificuldades na deteção de cor, outras disfunções na retina de doentes com Parkinson têm vido a ser descritas na literatura, com a deposição de a-sinucleína e da sua forma fosforilada em células ganglionares, coincidente com as características distintivas associadas à patologia. Apesar das dificuldades relacionadas com o estudo da retina humana que se mantiveram por muitos anos devido à ausência de modelos representativos, a última década esteve associada a melhorias consideráveis nesse campo de estudo, com a obtenção de células estaminais pluripotentes induzidas e consequente desenvolvimento de modelos 3D, como é o caso de organoides, descritos como sendo capazes de recapitular a organização e sensibilidade à luz características da retina humana. Com este trabalho, pretendeu-se contribuir para um maior entendimento dos efeitos da expressão aumentada da a-sinucleína nos mecanismos de degeneração da retina, através do desenvolvimento de organoides de retina derivados de células pluripotentes induzidas obtidas de paciente. Os objetivos principais do projeto prenderam-se com a geração de organoides com uma linha celular derivada de um paciente de Parkinson e a sua subsequente caracterização a diferentes estadios de desenvolvimento, e posterior avaliação de diferenças na suscetibilidade dos mesmos e do impacto da triplicação da -sinucleína no processo degenerativo do organoide. Com esse intuito, os organoides foram gerados de acordo com o protocolo descrito por Capowski et al., usando uma linha celular de paciente de Parkinson, com a triplicação do gene da a-sinucleína (SNCA), e administrando um único pulso de proteína morfogénica óssea 4 (BMP-4) ao sexto dia de diferenciação. Para as experiências iniciais, três linhas celulares foram usadas como controlo (IMR90, RBi001e TC-Lab). Após confirmação da sua pluripotência, a avaliação da competência de geração dos organoides foi efetuada através de análise de tamanho aos dias 6, 30 e 70, bem como observação da eficiência de geração de vesículas de neuroretina e presença do epitélio pigmentar. Os organoides de paciente não revelaram qualquer alteração relevante, apresentando sinais de desenvolvimento semelhantes aos controlos e validando a linha celular de paciente como tendo capacidade de gerar organoides de retina viáveis. Tendo em conta a ausência de diferenças entre os controlos utilizados, o seguimento das experiências foi efetuado utilizando apenas a linha IMR90, e a caracterização celular e avaliação de alterações moleculares foram executadas maioritariamente através de métodos de imunofluorescência, Western-Blot e análise de RNA. As análises aos dias 80 e 120 de diferenciação revelaram que os organoides gerados com a linha de paciente mostraram sinais de organização semelhantes aos controlos, expressando diferentes tipos de marcadores associados às diversas populações celulares da retina, incluindo células ganglionares, amácrinas e progenitores de fotorrecetores. Com o decorrer da diferenciação, foi possível observar uma diminuição de células ganglionares, aumento de células amácrinas e migração de progenitores de fotorrecetores para a camada mais exterior dos organoides, indicando que os organoides de ambas as linhas seriam dotados de capacidade para recapitular o processo de retinogénse humana. Em seguida, foram analisados os níveis de a-sinucleína ao dia 80 e 120 de diferenciação, observando-se que os organoides derivados do paciente apresentaram níveis mais altos de mRNA e proteína quando comparados com os controlos, bem como uma maior intensidade de fluorescência. Adicionalmente, foi observada uma acumulação da forma fosforilada da a-sinucleína no resíduo Serina 129, por Western-Blot, característica vastamente associada à Doença de Parkinson. Posteriormente, foram investigados parâmetros como níveis de enzimas antioxidantes, expressão de marcadores inflamatórios e o estado da mitocôndria. As enzimas antioxidantes como a catalase (CAT) e superóxido dismutases (SODs) 1 e 2 foram avaliadas entre os dias 30 e 120 de diferenciação, e os nossos resultados revelaram um aumento dos seus níveis de mRNA e proteína, indicando uma potencial resposta a stress oxidativo. Adicionalmente, em organoides gerados com a linha de paciente, foram observados níveis de mRNA mais elevados de marcadores como a interleucina 6 (IL6) e a proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1) aos dias 50, 80 e 120, coincidentes com uma maior resposta inflamatória. O estado da mitocôndria foi avaliado através da análise dos níveis de mRNA de membros da família do linfoma de células B 2 (BCL2), genes diretamente relacionados com a via mitocondrial e intrínseca de apoptose, em associação com o uso do corante lipofílico catiónico JC-1, capaz de se acumular na mitocôndria dependendo do seu potencial de membrana. Os nossos resultados aos dias 50, 80 e 120 de diferenciação revelaram um aumento significativo dos níveis de mRNA de BCL2, do regulador de apoptose BAX e do BCL2 antagonist/killer 1 (BAK1) em organoides de paciente quando comparados com os controlos, indicando uma possível disfunção da via mitocondrial de apoptose. Estes valores foram acompanhados de um rácio agregado/monómero de JC-1 diminuído entre os dias 120 e 150, indicando uma despolarização da membrana mitocondrial e um potencial de membrana reduzido em organoides de paciente. Como anteriormente descrito na literatura, a presença de fluorescência localizou-se predominantemente na área mais exterior do organoide, coincidindo com a localização de fotorrecetores. Finalmente, foi do interesse deste trabalho proceder à avaliação de células fotorrecetoras. Para o propósito, foram usadas técnicas de deteção de imunofluorescência em organoides com 180 dias, localizando cones e bastonetes. Contrariamente aos controlos, que manifestaram a presença destas células na zona externa do organoide, os organoides derivados do paciente, revelaram ausência de ambos os tipos de fotorrecetores. Em suma, os resultados obtidos indicam que a triplicação da SNCA poderá atuar como uma sobrecarga para as células, promovendo degeneração da retina através de mecanismos consistentes com as características distintivas da Doença de Parkinson e que isto é fidedignamente reproduzido em organoides 3D de retina. Este trabalho suporta a utilização dos organoides como um modelo interessante para o estudo dos mecanismos moleculares associados com a sobre expressão de a-sinucleína e as suas implicações em doenças degenerativas da retina. Adicionalmente, pode também validá-los como uma ferramenta para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas dirigidas e inovadoras contra o stress oxidativo e a degeneração induzidos pela a-sinucleína ou por outras condições patológicas que partilham as mesmas características.In humans, the major causes of vision loss and blindness are due to degenerative retinal diseases like glaucoma or age-related macular degeneration (AMD), that involve function loss or death of specific retinal cell types. Interestingly, recent studies have found retinal abnormalities in Parkinson’s disease (PD) patients and the deposition of a-synuclein in retinal ganglion cells (RGCs), a typical hallmark of this disease. In the last decade, the development of reliable models to study the human retina has significantly improved and three-dimensional (3D) models like organoids derived from human induced-pluripotent stem cells (iPSCs) have been described to recapitulate the cellular organization and light sensitivity of the human retina. This thesis work aimed to contribute to a further understanding of the effects of a-synuclein overexpression in the retinal degenerative mechanism by generating PD-patient iPSCs-derived retinal organoids. For this purpose, retinal organoids were generated according to Capowski et al. protocol, with a single early bone morphogenic protein (BMP-4) pulse using a PD-patient iPSC line displaying a triplication of the a-synuclein gene (SNCA). Cellular characterization and molecular alterations were evaluated by immunofluorescence, Western-Blot, and RNA analysis. The obtained results indicated that PD-patient retinal organoids were efficiently generated and self-organized compared to control organoids and that they recapitulated human retinogenesis with the expression of markers associated with different retinal cell populations. At different differentiation stages (day 80 and day 120) PD-patient organoids revealed higher levels of -synuclein protein and accumulation of its phosphorylated form in the serine 129 residue. This was accompanied by increased levels of antioxidant enzymes, such as catalase (CAT) and superoxide dismutases (SODs) 1 and 2, together with increased mRNA levels of inflammatory markers like interleukin 6 (IL6) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), indicating, respectively, a potential antioxidant and protective response, and increased inflammation. Members of the B cell lymphoma 2 (BCL2) family like BCL2, Apoptosis Regulator (BAX) and BCL2 antagonist/killer 1 (BAK1) also displayed higher mRNA levels in PD-patient organoids, accompanied by a decreased JC-1 aggregate/monomer ratio indicating, respectively, a possible disfunction related with the mitochondrial pathway of apoptosis and alterations in mitochondrial membrane potential in PD-Patient derived organoids. Finally, analysis at a later developmental stage (day 180) revealed that rod and cone photoreceptor cells were altered in PD-Patient derived organoids compared with control organoids. Overall, this work supports 3D organoids as a reliable model to study the molecular mechanisms involved in retinal degenerative diseases and may also further validate them as a tool for developing targeted and innovative therapeutic strategies against oxidative stress and degeneration induced by a-synuclein or by other pathological conditions sharing the same features.Com o patrocínio de Molecular Mechanisms of Disease Lab - CEDOC, Chronic Diseases Research Center, NOVA Medical School e Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT).Machado, Maria Luísa de LemosAmaral, Joana São José DiasRepositório da Universidade de LisboaSantos, Inês Mariana Abreu Aguiar Paz2022-02-182022-01-282025-02-18T00:00:00Z2022-02-18T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/54799TID:203015568enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:01:27Zoai:repositorio.ul.pt:10451/54799Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:05:35.168388Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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